基因工程抗体研究综述

1、基因工程抗体第一节抗体总论一 抗体研究历史（一）抗体一词的由来抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。1

2、896年Gruber和Durham发现了凝集素。1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。但事实上，具有

3、抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然

4、的或病理的球蛋白的免疫功能。（二）抗体的结构及其多样性由上述可知，30年代末期人们即已认识到抗体为大分子的球蛋白，通过研究还表明抗体为双功能分子，既能与相应抗原特异地结合，又具有固定补体，穿透胎盘等功能，但有关其精确的化学结构却所知甚少。1958年牛津大学的Rodney R. Porter以木瓜蛋白酶水解抗体分子，获得两个Fab和一个Fc片段，前者具有与相应抗原结合的功能，后者则具有其他生物学功能，洛克菲勒大学的Gerald M. Edelman采用来自骨髓瘤患者的均质免疫球蛋白，经过还原后证实免疫球蛋白含有两条重链及两条轻链，在此基础上Porter、Edelman及众多实验室均致力于免疫球蛋

5、白氨基酸序列的阐明。1969年，Edelman及同事最终成功地解出了免疫蛋白的一级序列1，并发现免疫球蛋白由若干功能区（domain）所构成，与抗原结合的功能区具有较高的变异性，其他功能区则相对保守。免疫球蛋白化学结构的阐明虽然为抗体的多样性(diversity)提供了物质基础，但并不能解释其形成的机制，根据推算，抗体的多样性可达108109，一个结构基因编码一条肽链的经典概念显然与之相勃。70年代末至80年代初，日本学者利根川进(Tonegawa)用核酸分子杂交技术研究了B细胞分化发育过程中抗体基因结构的变化，阐明了免疫球蛋白的V区基因的重排与突变构成其无限组合的可能性，从而解释了抗体多样性

6、的起源2。（三）抗体产生技术自上世纪末，以抗原免疫动物获得抗血清这一途径一直是获得抗体的经典方法。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术，这是抗体产生的重大技术革命。该技术的普及使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单隆抗体。由于单抗特异性强，性质均一，易于大量生产，在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献，并形成产业，成为生物技术的重要支柱之一。然而，单抗多为鼠源性，采用类似的原理制备人源单抗迟迟未获进展，极大地限制了单抗作为治疗制剂在人体内的应用。为克服鼠源单抗的异源性反应，80年代中期人们开始尝试基因工程方法改造鼠源单抗，即所谓单抗的“人源化（

7、humanized antibody）”，包括鼠Ig的V区与人Ig的C区拼接而成的嵌合抗体，或将鼠IgV区的CDR区移植到人Ig的V区拼接成的改型抗体3。同时，考虑到完整抗体的分子过大，不利于发挥“药物”的作用，从而采用基因工程方法使之“小型化”，如单链抗体（single chain antibody），为VH与VL直接相连，分子量仅为完整抗体的1/6。以基因操作的方式制备抗体却始于1989年底英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lerner小组创造性的工作，他们采用PCR方法克隆抗体全部的可变区基因（reptoire）并装于原核表达载体中，以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时称为组合

8、抗体库技术。90年代初期，这一技术有了进一步的发展，即将抗体基因（VH或Fd）与单链噬菌体的外壳蛋白合并表达于噬菌体表面，以固相化的抗原吸附相对应的噬菌体抗体，经多次“吹附洗脱扩增”即可筛选得所需抗体。这是抗体产生的又一次重大技术革命，首先该技术将抗体的基因型及表型密切连系起来，每轮操作可使特异性抗体富集102-103。噬菌体抗体库技术不仅摆脱了细胞融合等繁琐的操作，而且可不经免疫制备抗体，为制备人源抗体开辟了新途径。这一点已为实验所证实，然而由一个未经免疫的初级抗体库中筛选出理想的抗体肯定不是一件轻松的事情，由于人体不能随意免疫，转人Ig基因小鼠的尝试80年代后期即有进行，免疫后约4%的抗体

9、为人源。新近这一技术有了重大突破，首先采用同源重组技术将小鼠胚胎干细胞（ES）中的鼠Ig基因敲除（knock out），而后采用融合技术将YAC库中大片段人Ig基因（200MB）导入，筛选后代即可获得免疫后仅产生人抗体的转基因小鼠，转人Ig基因小鼠的商品化并与噬菌体抗体库技术相结合，终于使多年徘徊不前的人源抗体的产生取得了突破。由多克隆抗体到单克隆抗体，直至噬菌体抗体，由不均质的异源抗体到均质的异源性抗体，直至人源抗体，是抗体产技术的三个时代，从一个侧面反映了生命科学由整体水平、细胞水平、到基因水平水平的进展，同时也为抗体作为医药生技术产业的一个重要支柱奠定了基础。第二节抗体的结构和功能一、

10、抗体的分子结构（一）、抗体分子的基本结构尽管抗体分子是一个极不均一的分子群，既有许多不同的类和亚类，又表现出各不相同的抗原特异性，但所有抗体分子都有着相同的基本结构：二条相同的重链和二条相同的链组成的免疫球蛋白单体，重链（heavy chain）为分子量在5070KD的多肽链，轻链（light chain）,较短，分子量在23KD左右，每一条肽链可分为二个区域，重链氨基端的四分之一或五分之一与轻链氨基端的二分之一的氨基酸序列在不同抗体分子之间变化较大，称作可变区，其余部分称为恒定区，免疫球蛋白单体是对称性的分子，一个重链和一个轻链以一个二硫键和非共价键结合在一起，二个重链又靠非共价键及一个或多

11、个二硫键接在一起形成免疫球蛋白单体，有些抗体分子是由多个单体连接起来形成多聚体，如IgM可为五聚体，IgA可为二聚体。早在50年代末期，Porter和Nisonoff通过将免疫球蛋白用蛋白酶消化成不同的片段研究免疫球蛋白的结构，使人们对免疫球蛋白的基本组成有的初步的了解，由此形成对免球蛋白片段的命名也延用至今，在免疫球蛋的研究中仍在广泛使用。Porter用木瓜蛋白酶（papain）消化免疫球蛋白单体可得到二个相同的Fab(fragment with antigen binding)和一个Fc(fragment of crystallization)，前者可以和抗原结合，后者则与抗体的效应功有有

12、关。Nisonoff用胃蛋白酶水解得到由二个Fab段构成的片段，这是因为木瓜蛋白酶在重链间二硫键的羧基侧切断了重链，从而二个Fab段仍由链间二硫键连接在一起，而剩余的Fc段则水解成小分子肽。这一研究，结合电镜观察结果，导致了经典免疫球蛋白单体的Y型结构模式，其二个臂为每一个Fab段，由一个轻链和部分重链组成，Fc段则包含剩下的重链。除了Fab,Fc段和F(ab')2段，免疫球蛋白分子还可以分成其它不同的片段，VH为重链可变区，VL为链可变区。Fv是VH和VL结合在一起的片段，是抗体与抗原结合的最基本的单位，VH和VL之间没有二硫键，而是靠共非价键结合在一起的，在浓度较低的溶液中易于解离

13、，Fd段为Fab段中的重链部分，这些不同的片段对基因工程抗体的组建有重要的意义。（二）抗体分子的功能区结构抗体分子的轻链和重链都有若干个结构类似的功能区组成，每一个功能区含有大约110个左右氨基酸，内有二个半胱氨酸，二者间隔约60个氨基酸，所形成的链内二硫键使功能区成为一个环状结构，将不同功能区的氨基酸进行比较，可发现它们之间有明显的同源性，即有些位置的氨基酸有着高度保守性，如形成二硫键的二个半胱氨酸，与第一个半胱氨酸相隔约14个氨基酸的色氨酸等等，因此所有的功能区都有非常类似的立体结构：它们含有二个反向平行折叠片，这二个片层由链内二硫键连在一起，互相作用，形成一个球状结构；其核心为疏水区；在

14、恒定区，一个折叠片层含有四个反向平行肽链，另一个含有三个反向平行肽链，可变区与此类似，但二个折叠片都含有四个反向平行肽链，在反向平行链折返处的环状结构，其氨基酸序列的保守性要低一些，可变区这些环形成了抗原结合部位。轻链含有二个功能区，氨基端为可变区，羧基端恒定区，重链在不同的类或亚类可以有四个功能区或五个功能区，其氨基端为可变区，其余是恒定区，大部分重链在CH1和CH2之间有一个绞链区，绞链区的长度在1060多个氨基酸之间不等，其中IgD和IgG3的最长，分别含有64个和62个氨基酸残基，绞链区含有较多的脯氨酸残基，富有柔性，可赋予Fab段较大的自由活动，有利于抗体和抗原的结合，绞链区还有不等

15、数目的半胱氨酸，参于重链间二硫键的形成，由于绞链区较为伸展，易被蛋白酶消化。轻链和重链的可变区互相作用构成Fv段，形成抗原结合部位，可变区是在分析了大量免疫球蛋白氨基酸序列的基础上，发现其变化较多而得名。但分析结果表明氨基酸序列的变异并非随机地分布在整个可变区，而是集中在较小区段，这些区域被称为高变区，超变区，或互补决定区。轻链可变区有三个CDR区，按Kabat编号系统，其CDR1位于第2434位氨基酸，CDR2位于第5056位氨基酸，CDR3位于8997位氨基酸。由于可变区的长度变化，在不同的种属或不同的亚群，第27位可有16个氨基酸，第95位也可有16个氨基酸，它们在原编号的基础上加上英文

16、字母进行编位，如27A，27B，95A，95B等待，在重链可变区，初期曾认为有四个高变区，后经抗原亲和标记及立体构形分析，发现组成抗原结合部位的只有三个，故现在公认重链也有三个CDR区，它们分别位于第3135位，5065位，95102位氨基酸，同轻链可变区类似，在35位，52位82位及100位也可有多个氨基酸，以A，B，C，D等号，在可变区的立体构象中，CDR区位于连接反向平行折叠链环部，通过X线晶体衍射分析证实CDR区位于Fab段的未端，是抗体和抗原结合的部位。尤其是近年将小鼠单克隆抗体的CDR区移植到人抗体骨架区，使改型后的人单抗获得了与亲本鼠单抗相同的抗原特异性，更是确定无疑地证实了CD

17、R区是抗体与抗原的结合部位。(三)免疫球蛋白的不均一性免疫球蛋白是一组理化性质极不均一的蛋白分子，这种不均一性来自免疫球蛋白可变区和恒定区蛋白质一级结构的差异，对免疫球蛋白不均一性的研究最初是通过将免疫球蛋白作为抗原进行体内免疫，对抗血清进行血清学分析，对异种进行免疫主要鉴定同种型，对同种进行免疫主要分析同种异型，在同系动物或同一个体内则可分析独特型，这些血清学分析反映了免疫球蛋白在不同层次上组成成分的差异。1.同种型同种型指同一物种内共同具有抗原特异性，存在于恒定区，轻链称作型和亚型，重链称为类和亚类。同一种属内每一个体具有所有型和亚型的轻链基因及类和亚类的重链基因。(1)轻链：轻链有二种型

18、别，型和型，它们的分子量都是23KD，由214个氨基酸组成。在人类，链只有一个恒定区基因，不存在亚型，而链有多个恒定区基因。目前已鉴定出四个有功能的基因，即四个亚型，这四个亚型之间只有数个氨基酸的差别，由三个血清学标记所组成，其中第152位为甘氨酸时为kern+,为丝氨酸时为kern-4，第190位为赖氨酸时叫做Oz+，为精氨酸时叫做Oz-5，第112,114,163位为天门冬酰氨，苏氨酸和赖氨酸时为mcg+，为丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸时为mcg-6，这四种亚型分别为mcg+ke+Oz-，mcg-ke-Oz，mcg-keOz+，以及mcg-ke+Oz-。在人类抗体分子中，约60%为链，40%为链

19、，在小鼠，约95%为链，这是因为小鼠只有二个可变区基因，而链可变区基因在100个以上。(2)重链：哺乳类的重链可分为五类，和，某些类又可分为亚类，如在人类可分为四个亚类：1，2，3和4,可分为两亚类1和2。因此共有九个类和亚类，表明基因组内有九个有功能的重链恒定区基因，在小鼠，链也可分为四个亚类，1，2a,2b和3，重链的类和亚类决定了免疫球蛋白的类和亚类：它们是-IgM，1-IgG1，2-IgG2，3-IgG3，4-IgG4，1-IgA1，2-IgA2，-IgE，-IgD。免疫球蛋白的类和亚类与其含有的轻链型别无关，例如IgG1的组成成分可以是（1）2，也可以是（1）2。不同类或亚类的免疫球

20、蛋白在分子结构，血清浓度，体内分布，以及生物学功能上互不相同1）.IgG：IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，约占血清免疫球蛋白总量的75%。在人类的四个亚类中，其中IgG1含量最多，约占IgG总量的60%。IgG是机体抵抗病毒和细菌感染，中和毒素的重要抗体，并且是唯一可以通过胎盘使新新生儿获得被动免疫保护的抗体。不同亚类IgG的分子结构和生物学特性各不相同。2）IgM：IgM约占血清免疫球蛋白总量的10%，是初次免疫反应中最先产生的抗体，其链没有铰链区但有四个恒定区，血清中的IgM是由五个单体IgM组成的五聚体，分子量达900kDa，是分子量最大的免疫球蛋白分子，故又称巨球蛋白。单体IgM是

21、由CH3内半胱氨酸形成链间二硫键而组成的五聚体，在五聚体内还有另外一个多肽链，称作J链，与两个单体的羧基端以链间二硫键相连。IgM五聚体有多个抗原结合位点，如果结合半抗原可成十价，一般情况下由于空间位阻表现为五价。IgM可产生较强的补体结合反应和凝聚反应。膜表面型IgM是B细胞表面的主要免疫球蛋白，它和另外两个膜表面蛋白Ig和Ig形成受体复合物，是B细胞识别抗原而被活化的受体。3）IgA：IgA约占血清免疫球蛋白总量的15%，但在消化道分泌液，呼吸道分泌液，乳液，泪液等外分泌液中，它是主要的免疫球蛋白，称作分泌型IgA。IgA有两个亚类IgA1和IgA2，血清中的IgA绝大多数为单体以IgA1

22、为主。在外分泌液中则主要为双聚体，也有一些多聚体，以IgA2为主。外分泌液中的双聚体IgA是由J链在羧基端以链间二硫键连在一起，除了J链它还含有另外一个多肽链，称为分泌小体。这些肽链是如何连接在一起的现在还不十分清楚。在人类，分泌小体缠绕在双体IgA分子上，以共价键结合在一起。sIgA是粘膜局部抗感染免疫的重要成分，是通过乳汁将母亲的免疫力传给新生儿的重要途径。4）IgE：IgE是血清中含量最少的免疫球蛋白，仅为0.3ug/ml左右，重链有四个恒定区，没有绞链区。IgE含量最低，却具有很强的生物学活性。IgE可与肥大细胞和嗜碱性细胞表面的I 型IgE Fc受体（FcRI）结合，当IgE结合特异

23、性抗原而发生交连时，可激活这些细胞，使其脱颗粒，释放多种血管活性物质，如组织胺，5羟色氨等，导致I型过敏反应。IgE在抗寄生虫免疫中有重要功能。在单核巨噬细胞和噬酸性粒细胞表面有II型受体，可介导依赖于抗体的抗寄生虫细胞毒效应。5）IgD：IgD在血清中含量也很低，约40ug/ml左右，它极易被蛋白酶水解，在血清中半衰期很短，为三天左右。人类链有三个恒定区，在小鼠只有二个恒定区，CH1和CH2。IgD的绞链区有64个氨基酸，是免疫球蛋白中最长的绞链区，这可能是IgD易被水解的原因。IgD的生物学功能尚不明确，它和IgM一起组成了B细胞表面的主要抗原受体，推测在B细胞的活化中其重要作用。2.同种

24、异型同种异型指一种属内不同群体间免疫球蛋白分子所具有的不同抗原决定基，同人类血型一样，是由等位基因的多态性所造成的。因此每一个个体的特定的免疫球蛋白肽链可以有一种（纯合子）或两种（杂合子）。由于某一种同种异型只存在于同一种属一部分个体内，一般用同种抗血清来鉴定同种异型。在人类发现和重链，轻链存在有同种异型，分别命名为Gm,Am和Km。这些同种异型实际上反映了恒定区中个别氨基酸的差异。例如Km同种异型有三种，是由第153位和191位氨基酸引起，这些差异可诱发同种抗血清，说明它们位于分子的表面，其变化可产生新的抗原决定基，这一点已为X射线衍射所证实。IgG的四个亚类都存在有Gm因子，是由gamma

25、链恒定区个别氨基酸的差异所产生。人类IgA2发现了二个同种异型，命名为Am(1)和Am(2)，它们之间有四个氨基酸不同。决定同种异型的等位基因是共显性，因此在杂合子个体，血清中二种同种异型都存在，但在每一个抗体分子中，由于等位基因排斥（allelic exclusion），其二个重链的同种异型总量是相同的，同种异型的遗传遵循孟德尔定律。3.独特型独特型是指每一个抗体形成细胞克隆产生的抗体分子上所有的抗原特异性，是由轻链或重链可变区氨基酸序列不同所决定的，因此与抗体接合抗原的特异性密切相关。由于机体内存在有针对各种不同抗原的抗体，因此一个个体内有数量众多的独特型，在自身体内可产生抗独特型抗体，这

26、种独特型-抗独特型网络对免疫应答的调控有着重要的作用7。二、抗体分子的基因结构与重排 机体内有成千上万的B细胞，每一个B细胞克隆都表达有特异性的抗原受体，即膜表面Ig。不同B细胞克隆所表达的抗原受体具有不同的特异性，说明每一个个体都存在着数量巨大的抗原受体，即抗体的多样性，它是由免疫球蛋白可变区，尤其是CDR区决定的。另一方面，免疫球蛋白的恒定区具有类、亚类、型和亚型等有限的变化，恒定区的变化与可变区的多样性完全分离，同一个亚类重链可具有多种不同的可变区，而同一个可变区又可与不同类或亚类的恒定区组成重链。自从五十年代以后，随着免疫球蛋白氨基酸序列资料的积累使免疫球蛋白分子的基本结构得到阐明，就

27、提出了二个最基本的问题：从可变区和恒定区的结构和功能特点来看，似乎有着不同的遗传来源，它们如何会存在于同一条肽链？如此巨大数量的可变区是如何形成的？1965年Dryer和Bennet提出了一个大胆的设想：免疫球蛋肽链是由二组基因编码，一组数量巨大，含有可变区的遗传信息，另一组小得多，含有恒定区的信息。这与当时公认的原则：“一个肽链由一个基因编码”相矛盾。按照这个设想，一条肽链可以由二个基因或至少是二个基因片段编码，它还意味着可变区和恒定区基因必须拼接在一起才能转录并翻译成蛋白质分子。由于当时分子生物学实验技术手段不足，支持Dryer和Bennet假设的实验证据直到10年以后才出现。现在我们已知

28、道Ig肽链由不止一个基因编码的设想的原则是正确的，但免疫球蛋白的基因结构和重组远较Dryer和Bennet设想的要复杂的多。（一)抗体基因的基本结构免疫球蛋白的链基因、链基因和重链基因位于不同的染色体。在生殖细胞系或在除B细胞以外的其它细胞中，可变区和恒定区编码的基因片段在基因组DNA上是分开的。轻链和重链的基因结构又互不相同。l.轻链基因的基本结构 (1)链：人和鼠的链基因结构非常类似，由三种分离的基因片段组成，它们是Vk，Jk和Ck。Ck编码恒定区，只有一个基因。J基因段编码链可变区第96108位氨基酸8，人和鼠都有五个J基因段，小鼠的Jk3没有功能，因其3端缺乏RNA拼接信号(内含子5端

29、的剪接信号为GT，但在小鼠Jk3的3端是CT)9。五个Jk基因之间约相距300个硷基，最后一个J与CK相距约2.53.7kbp。Jk与Vk在人类相距23kbp。Vk 编码链可变区的195位氨基酸，其确切数目还不确定，目前估计约有100多个Vk基因，其中有相当一部分不能合成有功能的蛋白质，称做假基因(pseudogene)。其原因有编码区出现终止密码子，因插入或缺失造成的阅读框架位移，或因关键氨基酸突变使所产生的蛋白无法进行正确折叠等10。假基因虽不能直接与J链拼接成有活性的可变区基因，但它们仍可作为可变区信息库通过基因转换(gene conversion)或不对称重组增加链的多样性。 典型的V

30、k基因含有上游调控序列，前导序列。在前导序列内含有一个内含子。序列所编码的前导肽对抗体分子进入粗面内质网，最终表达在细胞膜表面或分泌到胞外有重要作用。当免疫球蛋白的肽链进入粗面内质网腔后，前导肽被信号肽酶切去，故前导肽不存在于成熟免疫球蛋白分子。 Vk基因可根据其序列相似程度不同分成不同的亚群，一般将DNA序列有的80以上相同的Vk基因片段归为一个亚群。在DNA杂交实验中，同一亚群的Vk基因可在较严格的条件下杂交，而不同的亚群之间的杂交信号很弱。亚群的划分是人为的，有些Vk基因难于归入某个亚群。但亚群在一定程度上反映了可变区基因在种系进化中的关系。目前在人类发现有七个亚群。在链基因位点中，同一

31、亚群的Vk基因有分布于同一区域的趋势。但不同亚群的Vk基因群常常混合分布，可能与进化过程中的基因转位(transposition)和基因扩增有关。 Vk基因分布在至少2000kbp范围的基因组DNA内，其确切边界和其位点内是否含有其它基因还不清楚。(2)链：链也由三个基因片段编码，V和J组成可变区，V编码195位氨基酸，J编码96108位氨基酸，恒定区由独立的外显子编码。由于k链有不同的亚型，每一个亚型有各自的恒定区基因。链基因的结构与链有所不同，每一个C基因有其自己的J基因片段，形成J-C结构，而J-C基因集中在一起形成J基因群。人类有七个C基因，J与V基因相距14kbp，在七个V基因中C1

32、相应于mcg+亚型，C2相应于ke-Oz-亚型，C3相应于ke-oz+亚型，C4、C5和C6为无功能的假基因，C7属ke+oz-亚型。人类V基因目前鉴定出十个亚群，最近已克隆出了36个V基因，其中12个为假基因，从DNA印迹杂交实验估计人类V基因的总数可能在70个左右。在小鼠则仅有二个V基因，这与小鼠血液中只有5%Ig含有轻链相一致。小鼠有四个V-C基因，每一个V基因跟随着二个JC，V1后面是J1C1和J3C3，V2后面是J2C2和J2-C4，其中J4-C4是假基因，在J和C之间有一个1.21.4kbp的内合子。V2可以和任何一个JC重组，而V只可以和J3，J1发生重组。2.重链基因的基本结构

33、 重链基因和轻链基因的结构有二点主要区别：一是可变区由三个基因片段编码，它们是VH(varlable)，D(diversity)和JH(joining)。二是重链所有同种型的恒定区基因集中在一起，位于可变区基因段的下游。VH基因与轻链的V基因类似，由二个外显子组成，第一个外显子编码大部分前导肽，第二个外显子编码前导肽羧基端四个氨基酸和可变区195位氨基酸，二个外显子之间有大约100个硷基对左右的内含子。人类VH的数目现已比较清楚，大约有50个左右具有功能的VH基因，共分六个亚群。另有约几十个假基因，具体数目尚不清楚。假基因可通过间接方式增加抗体的多样性。小鼠VH数目尚不确定，估计数百个左右，共

34、分十个亚群。 D基因片段所编码的肽段构成了CDR3的主要成分，它没有固定的阅读框架，且长短不一，短者可仅编码三个氨基酸，长者可编码十几个氨基酸，因此其确切数目难以估计。目前在人类已发现30多个D基因，在小鼠发现十几个D基因。D基因群在VH基因群和JH基因群之间，分布在大约70一80kbp的DNA范围内，在VH基因之间也可以发现散在的D基因片段11。 在D基因群的下游是JH基因群，JH编码重链可变区羧基端1621个氨基酸，其氨基端的49个氨基酸与D片段共同组成CDR3。人类有九个J基因段，其中有三个假基因，小鼠有四个J基因段。距JH基因群下游约7000个硷基为重链恒定区基因群。重链恒定区基因群含

35、有所有重链同种型的恒定区基因，在小鼠有八个恒定区基因，分布在200kbp的范围内，在人类有11个恒定区基因，其中有二个假基因，其确切长度尚不清楚。恒定区基因之间除C和C之间相隔45kbp外其它都相距数万个硷基，每一个恒定区基因由四到六个外显子组成，每一个功能区及绞链区由独立的外显子编码，3端的12个外显子为膜型Ig的穿膜区和胞内区编码。(二)可变区基因的重组及其机制由于可变区分成数个基因片段编码，每一个基因片段以基因群的方式存在，因此只有通过基因重组使各基因片段，即V-J或V-D-J连接起来才能形成有功能的完整的可变区基因。1轻链可变区基因的重组轻链可变区基因由V-J重组完成，任何一个Vk或V

36、基因与某个Jk或J经基因重组连在一起，即可形成一个有功能的轻链可变区基因。在V-J重组时，接头处可发生核苷酸的错位和变化，从而增加CDR3的多样性。2重链可变区基因的重组重链可变区基因的重组由于多了D基因片段而较轻链更为复杂。首先发生的是D-J重组，将一个D基因片段和一个JH基因连接起来，然后进行V-J重组，一个VH基因与重排后的DJ连接形成有功能的重链可变区基因。D-J和V-DJ重组时接头处的变化比轻链V-J接头处的变化要大得多，如在D-J和V-DJ重组时末端的核苷酸可以被酶解，还可通过末端核苷酸转移酶的作用加上新的核苷酸，称作N区(nongermline encoded nucleotid

37、es)12，它大大增加了重链可变区CDR3的多样性。3可变区基因重组的机制 (1)重组信号序列：V-(D)-J重组的机制还未完全阐明，但通过对这些基因片段两侧DNA序列的分析，在VH和VL的3端，J基因的5端和D基因的两端发现了高度保守的重组信号序列(recombination signal sequence，RSS)13。它包括一个七核苷酸组成的七聚体(heptamer)和一个九个核苷酸组成的九聚体(nonamer)，二者间隔12土1或23士1个核苷酸。VL和JL，VH和DH以及DH和JH之间的七聚体和九聚体为反向互补序列，如J基因5端的七聚体序列为CACTGTG，九聚体序列为ACAAAAA

38、CC，分别与V3端的七聚体CACAGTG和九聚体GGTTTTTGT为反向互补序列，这些互补序列可以形成茎-环状结构(stem-and-loop structure)。七聚体和九聚体之间间隔序列的长度是固定的，为12土1或23土1个核苷酸它决定了重组的模式，只有间隔12个硷基对和23个硷基对的重组信号序列之间发生重组，而间隔长度相等的重组信号序列之间不发生重组，这就是12/23硷基对规律14，由于12或23硷基对分别相当于DNA双螺旋的一或二圈，也叫做1+2圈规律，这个规则保证了重组以正确的方式进行，尤其在重链，只有D-J，V-DJ之间发生重组，而不会产生V-J重组。 (2)重组模式：通过重组信

39、号序列进行重组的具体模式有以下三种： i缺失模式(deletion model)15：以VL-JL重组为例，VL3端的重组信号序列和JL5端的重组信号序列通过七聚体和九聚体形成茎-环状结构，将VL和JL基因端带到了一起，然后通过重组酶（recombinase）的作用进行切除和连接，将VL和JL连在一起形成完整的轻链可变区基因，而VJ之间的环，则通过七聚体末端之间的连接形成一个环状DNA分子。在淋巴细胞中能检测到这种环状分子，证明了缺失模式的存在。 ii倒转模式(inversion model)16：当重组信号序列同处于二个基因段的同一侧时，上述重组过程不是造成二个重组基因间DNA序列的环化和缺

40、失，而是这段DNA的倒转，倒转后V-J连接成可变区基因，在D基因段二端均有重组信号序列，因此DJ重组可通过以上二种模式进行。在基因组中发现有反向排列的V基因说明这些V基因通过倒转模式进行重组，在体外模式实验中发现，在二个方向的重组信号序列都存在的情况下，倒转模式和删除模式发生的几率几乎相等。因此，根据基因组中Vk基因群的排列方向，大约可有半数Vk-Jk的重组可能涉及倒转模式。 iii姊妹染色体交换模式(sister chromatid exchange model)17：通过姊妹染色体之间的不对称交换或重组(unequal crossing over or recombination)可在二条

41、染色体之间进行V-(D)-J重组。这种机制在理论上可能存在,但尚未发现直接证据。 (3)重组涉及的酶：上述各种V-(D)-J重组机制均涉及到重组信号序列的识别，编码端和七聚体接头处的切割，DNA断端硷基的删除、添加及修补，以及断端的连接。这一过程中所涉及到的酶系统还未完全阐明，目前所了解的有以下几种： i末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT)18：参与了重组接头处核苷酸的添加，与N区的形成密切相关。 ii发现了可以与七聚体和九聚体序列结合的蛋白质，其中与七聚体结合的蛋白的编码基因已被克隆，但其具体的作用机制还有待进一步研究。iii目前研究较多的是二个重组激活基因（recombination acti

42、vating genes，RAGs）19，RAGl和RAG2，它们在同一基因位点，二者仅相隔几千个硷基对，但二个基因之间并无同源性。RAGl和RAG2在进化中非常保守，如人与小鼠的RAGl有90的氨基酸相同。RAGl和RAG2在V(D)J重组中的具体作用方式尚不明确，但两者的存在与重组活性密切相关，将二者同时转入成纤维细胞即可使原来没有重组酶活性的纤维母细胞产生重组酶活性而发生Ig基因重组，说明RAG1和RAG2是重组酶系统中的关键成分。4CDR3的多样性 Ig可变区中以CDR3的变异性最大，有人估计人重链CDR3的多样性可达1014以上。事实上CDR3的多样性是抗体多样性的主要来源，V-(D

43、)-J重组的接头部位都位于CDR3内，重组过程中有多种机制可增加其多样性。 (1)接头处多样性(junctional diversity)20：在V-(D)-J重组时重组信号序列末端的连接和编码序列末端的连接有很大差异，信号序列末端的连接一般较准确，未发现有硷基丢失的现象，添加新的核苷酸的现象也很少发生。但编码序列末端的连接一般不准确，常可见到1-10个核苷酸的丢失和添加，所添加的核苷酸有二种，一种叫做N区或N核苷酸(N-region N-nucleotides)，N代表non-germline encoded nucleotides，意为非生殖细胞系编码的核苷酸。这种新的核苷酸的添加是由末端

44、脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)所催化的，一般以GC较为多见，N区只发生在重链可变区的DJ和VD接头处。另一种叫做P核苷酸(P nucleotides)，P取自Palindrom，因为它总是邻近于编码序列的末端并与编码序列末端的硷基互补。P核苷酸一般只有1-2个硷基，只存在于完整的编码序列末端，因此人们推测P核苷酸的形成是V-(D)-J重组时的固有特性，它实际上来自DNA的互补链，通过二条链末端二个硷基间的相互连接，同时在互补链倒数第一二或第二三个硷基之间打开缺口，使该链末端的1-2个硷基连到另一条链上，造成突出的单链末端

45、，再通过DNA聚合酶补平，形成P核苷酸。因此P核苷酸本质上是基因组所携带的信息。单链突出的末端也可成为DNA外切酶的底物被水解删除，造成编码区末端的缺失，并可通过TdT活性添加核苷酸形成N区，因此在有N区形成时见不到P核苷酸。 (2)来源于D基因段的多样性：由于重链可变区比轻链多一个D基因段，使重链的CDR3的多样性更为突出，除了基因组DNA多副本D基因段和上述接头处的变化外，还有其他机制可增加D片段的多样性： i D片断没有固定的阅读框架，随V-D-J重组时接头处的变化所决定，因此有三种可能，D-J重组时可以有缺失模式或倒转模式，后者造成D段的倒转，又增加了三种可能的氨基酸序列，使一个D基因

46、段可以形成六种不同肽段。 ii D-D融合（D-D fusion）21：由于D基因段二端的重组信号序列中七聚体和九聚体都是间隔12个硷基对，D-D重组违背1223硷基对规则；但经过大量CDR3序列的分析发现10以上的CDR3含有融合的DD片段，对于D-D重组发生的机制还不完全明确，有人发现D基因段内存在隐蔽的不典型重组信号序列，可造成D-D重组，但经序列分析，D基因段内不典型重组信号序列存在率不高，不足以解释如此高频率的D-D重组。姊妹染色体不对称交换可以是D-D重组的机制之一，但它在体内是否D-D重组的真正原因尚不能确定。 iii DIR基因(DH genes with irregular

47、recombination signals)22：在Ig基因组D位点，除了常规的D基因段，还发现有约90个硷基长的DNA序列，其两端有多个七聚体和九聚体重组信号序列，在七聚体和九聚体之间的间隔序列既有12个硷基也有23个硷基，因此它可以形成V-D-DIR-J，V-DIR-D-J及V-D-DIR-D-J等多种不同形式的重组，而增加CDR3的多样性，目前已发现有7的人类CDR3含有DIR基因序列。(3)V-V(D)J重组和V(D)J-J重组：V(D)J重组完成以后的可变区基因还可以和上游的、V基因再次重组，造成VH替换(V replacement)，或和下游的J基因再次重组，这些重组仍可产生接头处

48、的变化，如形成P核苷酸及N区。关于其发生的机制目前认为存在于VH3端及重组后VDJ基因3端的与重组信号相类似的序列介导了VVDJ和VDJ-J重组。 5抗体多样性的来源 随着对Ig基因结构和重组机制了解的深入，抗体多样性产生的机制逐渐得以阐明，大体上可将抗体多样性的来源分成三部分： (1)胚系细胞所携带的遗传信息，它包括多副本的V基因，D基因，J基因及轻链重链等随机配对所形成的多样性，如按50个VH基因，30个D基因，6个JH基因，100个Vk基因，5个Jk基因计算,这种细胞固有的多样性可达：50×30×6×100×54.5×106 (2)B细胞

49、个体发生过程中由于V-(D)-J重组时接头处的变化所产生的多样性，这种变化发生在CDR3,包括重组时编码端核苷酸的删除，添加，P核苷酸和N区的形成等，其中有些是在基因原有遗传信息的基础上的变化，如接头处不准确连接所造成的编码匡架的变化，D段阅读框架的变化，以及P核苷酸的形成等，有些则与基因DNA中携带助信息无关，如N区的形成。据估计CDR3的多样性可达1014。 (3)体细胞突变（somatic mutation）23亦称高突变(hyper mutation)发生于B细胞受到抗原刺激后的分化发育阶段。免疫系统在接触原以前通过各种机制已形成了数量巨大的免疫球蛋白群体(repetoire)，可以结

50、合自然界中各种各样的抗原，但这还不足以对机体提供充分的免疫保护，因为大多数抗体的亲和力都比较低。抗原进入机体后刺激B细胞进一步分化，同时抗体基因发生体细胞突变，突变后亲和力得到改善的细胞克隆经抗原选择后具有较大的生长优势，从而在再次免疫反应中所产生的抗体具有较高的亲和力，这个亲和力增高的过程叫做亲和力成熟(affinity maturation)。亲和力成熟过程中的体细胞突变仅发生于重组后的可变区基因及其3端和5端200个左右硷基以内而不见于恒定区，主要是点突变，也可有插入和缺失，其突变率约为10-3-10-4/代，是同一细胞中其它基因突变率(10-6-10-8)的1000倍以上，这个突变率是

51、既能产生最大序列多样性又不破坏蛋白质的结构的最佳突变率，体细胞突变具有以下几个特征：对ACTG四种硷基没有选择性，也不局限在CDR区，很少发生于初次反应，尤其初次免疫反应早期产生的IgM抗体，没有超突变，在分化到浆细胞后超突变停止，这有利于保证高亲和力抗体的持续性分泌。超突变是T细胞依赖性的，只见于T细胞依赖性抗原(TD抗原)诱发的抗体反应。超突变产生的机制尚不明确，现已知其发生的部位在生发中心(germinal center)，生发中心是由寡克隆B细胞在树突状细胞所呈递的抗原刺激下增殖所形成，在这增殖过程中，可变区基因发生体细胞突变，突变后的子代经受抗原的选择，不能与抗原结合者发生凋亡(ap

52、optosis)，亲和力高者则具备选择优势，通过这一过程产生高亲和力的子代，并进一步分化成浆细胞或记忆性B细胞。通过以上多种先天或后天机制，使抗体可以具有无限的多样性，既可使机体识别任何一种外来抗原，又可在抗原刺激后提高抗体的亲和力，对机体提供有效的保护作用。第三节基因工程抗体杂交瘤-单克隆抗体技术和DNA重组技术所取得的成就促进了基因工程抗体技术的发展，最初出现的基因工程抗体是八十年代初报道的人鼠嵌合抗体(chimeric antibody)24，随后出现了人改型抗体(reshaped human antibody)25，小分子抗体，抗体融合蛋白(antibody fusion protei

53、n)等在基因水平上经过改造的单克隆抗体。从八十年代末期到九十年代初期，在(1)大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction PCR)扩增抗体可变区基因26以及(3)通过噬菌体表面表达系统(phagedisplay)进行高效筛选等技术发展的基础上建立了抗体库技术，可通过基因工程手段在原核细胞体系直接克隆到特异性抗体的基因。这一革命性的进展对抗体的制备、改造及新型抗体的开发带来了深刻的影响，标志着抗体技术经历了第一代抗体血清多克隆抗体，第二代抗体单克隆抗体发展到了第三代抗体基因工程抗体。一、基因工程技术改造的抗体(一)鼠单抗的人源化单

54、克隆抗体的问世极大促进了抗体在各个领域的应用，在临床检测中发展了许多以单抗为基础的检测手段，但单抗在体内治疗上的应用发展缓慢，其主要原因之一是：由于人杂交瘤体系的低效性、迄今的单克隆抗体主要是鼠源性的，鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起针对异种蛋白的免疫反应，产生抗小鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)27，HAMA既可影响单抗的治疗的效果，又可能诱发过敏反应。降低鼠单抗的异源性是解决这一难题的重要途径之一。目前将鼠单抗人源化的方法有以下几种：1鼠单抗恒定区的人源化；人-鼠嵌合抗体(human-mouse chimeric antibody)：抗体分子是双

55、功能分子，其与抗原特异性结合的活性存在于轻链和重链的可变区，即Fv段。抗体分子作为异种蛋白诱发免疫反应的抗原性则主要存在于恒定区，因此最初出现的人源化鼠单抗就是将鼠单抗的可变区与人抗体的恒定区拼接而成的嵌合抗体。它完整地保留了亲本鼠单抗的特异性和亲和力，同时大大降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体的构建主要涉及以下三部分内容(1)可变区基因的克隆：有二种技术路线从分泌亲本鼠单抗的杂交瘤细胞中克隆可变区基因：用适当的探针从该杂交瘤细胞系的基因组文库中钓取28或用PCR方法从细胞mRNA扩增。细胞基因组中有多个V基因，只有经过V(D)J重组的V基因才能表达，因此可用适当的J区探针从基因组文库中钓取含有重

56、组后V基因的克隆，获得可变区基因，V(D)J重组造成DNA限制性内切酶谱的改变，通过DNA印迹分析(southern analysis)可将已发生V(D)J重组的克隆和末发生重组的克隆区分开。在构建基因文库时可先用DNA印迹分析从细胞DNA酶解物中鉴定出含有重组后可变区基因的限制性内切酶片段、再分离该特定分子量的内切酶片段，构建可变区基因富集的基因文库，可使筛选工作更易于执行。多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的建立和发展为抗体可变区基因的扩增提供了简便有效的方法，尽管抗体分子可变区有着数量巨大的多样性,但其骨架区的序列相对保守，其前导序列也相对保守，因

57、此用第一骨架区序列或前导序列作为5'端引物，以J段或恒定区序列的互补DNA为3'端引物,以杂交瘤细胞总RNA为模板，通过逆转录PCR(RT-PCR)，很容易克隆到可变区基因。这个方法较上述基因文库法要简便容易得多，但有三点缺陷：一是PCR克隆的可变区基因来自mRNA，因此没有内含子剪接信号和表达调控元件，这些成分需由表达载体提供，载体构建难度较大。二是以骨架区序列为引物进行PCR扩增时由于引物的简并性及必要的内切酶位点的引入，可造成个别氨基酸的改变。尽管抗体的特异性和亲和力主要取决于CDR3，骨架区仍有一定的作用，Ig立体结构分析发现氨基端(第一骨架区)的氨基酸残基涉及到CDR

58、平面的形成，因此骨架区个别氨基酸的改变有可能影响抗体的亲和力。由前导序列和恒定区设计引物进行扩增则可避免这一缺陷，但由于前导肽序列变异较大，引物设计难度较高，目前还没有把握将100的可变区基因扩增出来，三是用于PCR的聚合酶多有错配倾向，一般可有千分之几的错配率，可造成扩增产物的改变，因此在扩增时要选取数个克隆进行DNA序列分析，以保证所得克隆没有PCR引起的突变。(2)表达载体的构建：嵌合抗体的表达载体因可变区克隆的方式不同而分成三类：从基因文库所克隆的可变区基因作为独立的外显子带有上游的转录调控元件及内含子剪接信号，因此载体应携带的基本成分包括：细菌内增殖所必须的抗菌素抗性基因和质粒复制的起始序列(origin)，在真核细胞进行选择的显性选择标记基因，人Ig恒定区基因及3端的转录终止信号和多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)。如从cD