第十二章维生素类药物分析

1、一、掌握维生素一、掌握维生素A、B1、C、E的结构性质与分析方的结构性质与分析方 法之间的关系；法之间的关系；二、掌握维生素二、掌握维生素B1、C、E的含量测定原理和方法。的含量测定原理和方法。三、了解维生素三、了解维生素A的含量测定原理和方法。的含量测定原理和方法。四、了解维生素四、了解维生素D性质和分析特点。性质和分析特点。维生素：维生素： 是维持人体正常代谢机能所是维持人体正常代谢机能所必需的必需的 微量营养物资。微量营养物资。 人体不能合成维生素。人体不能合成维生素。概概 述述脂溶性脂溶性水溶性水溶性 VitB族族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺、叶酸、烟酸、

2、烟酰胺VitMVitPP第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析维生素维生素A1 A1 活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。来源：来源： 1.1.天然产物天然产物 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。来源：来源： 2.人工合成产物 全反式维生素A醋酸酯 中国药典收载的VA是人工合成的VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有VAD胶丸和VAD滴丸。药典收载情况：药典收载情况：V VA A及醋酸及醋酸酯

3、棕榈酸酯棕榈酸酯混合物酯混合物的食用油的食用油溶液溶液。人工合成的人工合成的V VA A醋酸酯结醋酸酯结晶加精制植晶加精制植物油制成的物油制成的油溶液，其油溶液，其制剂有制剂有V VADAD胶胶丸和丸和V VADAD滴丸滴丸。浓缩浓缩V VA A油混合油混合物物Ch.PUSPBP-H 维生素维生素A醇醇-COCH3 维生素维生素A醋酸酯醋酸酯-COC15H31 维生素维生素A棕榈酸酯棕榈酸酯R : 维生素维生素ACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3环己烯环己烯共轭多共轭多烯侧链烯侧链存在多种立体异构化合物存在多种立体异构化合物具有具有UVUV吸收吸收

4、易发生脱氢、脱水、聚合易发生脱氢、脱水、聚合 反应反应为一个具有共轭多烯侧链的为一个具有共轭多烯侧链的 环己烯环己烯（一）（一）结构与性质结构与性质一、一、v 具有具有UV吸收吸收v 存在多种立体异构化合物存在多种立体异构化合物max 相对生物效价相对生物效价VitA2VitA3v 易发生脱氢、脱水、聚合反应易发生脱氢、脱水、聚合反应CH2OHCH2鲸醇鲸醇CH2OHCH2OHCH3酸酸醛醛环氧化物环氧化物、氧化剂、氧化剂紫外线、紫外线、VitAVitAVitAOO2v 或有金属离子存在时氧化或有金属离子存在时氧化共轭多烯侧链共轭多烯侧链 易被氧化易被氧化（二）（二）环氧化物环氧化物VitA醛

5、醛VitA酸酸OCH2OHHOCCOOH（三）（三）与三氯化锑发生呈色反应与三氯化锑发生呈色反应紫紫红红蓝蓝色色3SbClVitACHCl3溶解性溶解性（四）（四）不溶于水不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等易溶于有机溶剂和植物油等三氯化锑反应三氯化锑反应（一）（一）条件条件 无水无醇无水无醇紫紫红红蓝蓝色色 3SbClVitACHCl3鉴别鉴别二、二、-RCOOSbCl5+CH2蓝色蓝色紫红紫红+CH2-RCOOSbCl5（BP（1998）VitAVitAHCl去水去水无水乙醇无水乙醇max为为326nm一个吸收峰一个吸收峰UV法法（二）（二）max为为350390nm三个吸收峰三个吸收峰去水去

6、水VitA（VitA3）CH2VitACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3USP 显色剂显色剂 磷钼酸磷钼酸 规定斑点颜色和规定斑点颜色和Rf值值BP 杂质对照品法杂质对照品法 显色剂显色剂 三氯化锑三氯化锑TLC法法（三）（三）立体异构体立体异构体氧化产物及光照产物氧化产物及光照产物合成中间体合成中间体去氢维生素去氢维生素A（ VitA2）去水维生素去水维生素A（ VitA3）UV法法（一）（一）含量测定含量测定三、三、三点校正法三点校正法1. 条件：条件：（1）杂质的吸收在）杂质的吸收在310340nm波波长范围内呈一条直线，且随波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；长的增大

7、吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。）物质对光的吸收具有加和性。2. 波长的选择：波长的选择：（1） 1 VitA的的 max（328nm）（2） 2 3 分别在分别在 1的两侧各选一点的两侧各选一点测定对象测定对象 VitA醋酸酯醋酸酯328340316328 第一法第一法 等波长差法等波长差法 3403163283282523AAA.A 校校正正第二法第二法 等吸收度法等吸收度法(皂化法皂化法)测定对象测定对象 VitA醇醇32176 AAA 334310325325260455528156A.A.A.A 校校正正3.测定法测定法（1）基本步骤）基本步骤:v第一步第一步 A选择选择

8、选择依据：选择依据：所选所选A值中杂质的干扰已基本消除值中杂质的干扰已基本消除注意：注意： C 为混合样品的浓度为混合样品的浓度 第二步第二步 求求)(%cm1样样 l(%)CA%)(cm1 样样)()(%cm1%cm1纯纯样样 第三步第三步 求效价求效价换算因数换算因数）效价（效价（样样样样 %)(cm1)(Eg/IU换算因数由纯品计算而得：换算因数由纯品计算而得：%)(cm1Eg/IU纯纯）效价（效价（换算因数换算因数醋酸酯醋酸酯维生素维生素Ag344. 0IU1 2907000g344. 0g101g/IU6 ）效价（效价g/IU%)(cm1 纯纯）效价（效价（

9、换算因数换算因数1900 醇醇维生素维生素Ag300. 0IU1 3330000g300. 0g101g/IU6 ）效价（效价g/IU%)(cm1 纯纯）效价（效价（换算因数换算因数1830 第四步：求标示量第四步：求标示量标示量标示量平均丸重平均丸重100g/IU 标示量标示量丸丸标示量标示量100/IU 标示量标示量平均丸重平均丸重换算因数换算因数100CA 方法：方法：（2） 第一法第一法维生素维生素A醋酸酯醋酸酯iAnm360340328316300ml/IU159S处测处测、分别于分别于溶液溶液环己烷环己烷 判断判断 是否在是否在326329nm之间之间ma

10、x max 在在326329nm之间之间改用第二法改用第二法是是否否 求算求算 并与规定值比较并与规定值比较328iA/A 299.0AA811.0AA0000.1AA907.0AA555.0AA328360328340328328328316328300 规定值规定值 差值差值328iA/A 判断差值是否超过规定值的判断差值是否超过规定值的02. 0 有一个以上有一个以上超过超过02. 0 无超过无超过02. 0 计算计算 A328（校正）（校正） 用用A328计算计算%100AAAf328328)(328 校正校正 3403163283282523AAA.A 校校正正03%15%3%第二法

11、第二法 校校正正328A328A第二法第二法A300 /A328 ：0.555A316/A328 ：0.907A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.811A360/A328 ：0.299 求本品中维生素求本品中维生素A的含量？的含量？A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.833A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.010.01 0 + 0.02 + 0.04 6050523056106280252325233403163283

12、28.AAA.A 校正校正=%)3%15(%7 . 3%100AAAf328328)(328 校正校正 %0 .99%1001000008262. 010020125022399. 01900605. 0%100)ml100/g(C1900A%328 标示量标示量平均丸重平均丸重标示量标示量校正校正适用于维生素适用于维生素A醇醇第一法无法消除杂质干扰时用此法第一法无法消除杂质干扰时用此法 皂化法、皂化法、6/7A法法 （3）第二法）第二法i/KOHAnm334325310300ml/IU159VitAVitAS处测处测、于于稀释至稀释至溶解溶解异丙醇异丙醇除去植物油的干扰除去植物油的干扰甘油和

13、脂肪酸盐甘油和脂肪酸盐植物油植物油醇醇醋酸酯醋酸酯皂化液皂化液挥干乙醚挥干乙醚乙醚提取乙醚提取乙醇乙醇 水溶性水溶性脂溶性脂溶性 判断判断 max是否在是否在323327nm之间之间取未皂化样品取未皂化样品采用色谱法纯采用色谱法纯化后再测定化后再测定 计算计算325300AA是是否否 判断判断 A300 /A325 是否大于是否大于0.73是是否否取未皂化样品取未皂化样品采用色谱法纯采用色谱法纯化后再测定化后再测定 计算计算A325(校正校正)%100AAAf325325)(325 校正校正 334310325325260455528156A.A.A.A 校校正正03%3% 校校正正325A3

14、25A 校校正正325A三氯化锑比色法三氯化锑比色法蓝蓝色色 3SbClVitA优点优点 简便简便 快速快速max 618nm620nm标准曲线法标准曲线法 SbOClSbClOH32缺点缺点呈色不稳定呈色不稳定 （5 10s内）内）水分干扰水分干扰与标准曲线温差与标准曲线温差1专属性差专属性差三氯化锑有腐蚀性三氯化锑有腐蚀性NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+ 维生素维生素B1HClCl-氨基嘧啶环氨基嘧啶环UV还原性还原性噻唑环噻唑环（一）（一）溶解性溶解性1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性（二）（二）UV共轭双键共轭双键max = 246nm结构与性质结构

15、与性质一、一、嘧啶环嘧啶环 伯氨伯氨噻唑环噻唑环 季铵季铵1、可与酸成盐、可与酸成盐2、与生物碱、与生物碱3、含量测定、含量测定 非水碱量法非水碱量法 蓝色荧光蓝色荧光硫色素硫色素正丁醇正丁醇 OOH（三）（三）硫色素反应硫色素反应（四）（四）碱性碱性荧荧光光消消失失蓝蓝色色荧荧光光硫硫色色素素正正丁丁醇醇）（环环合合 HCNFeKOHNaOHVitB6321O OHChP鉴别试验鉴别试验二、二、（一）（一）硫色素反应硫色素反应CH2NNH3CNH2CH3NNaSC2H4OHONNH3CNH2HClNSCH3C2H4OHCH2NaOHNNH3CNNNaSCH3C2H4OH-H2O硫色素硫色素S

16、CH3C2H4OHNNH3CNNH 环合环合NNH3CNNSCH3C2H4OH H22HVitB1 4242HgIHBHgIK 淡淡黄黄H+ 2KIIIHIB2 红色红色H+白色白色硅钨酸硅钨酸 H+ OH4WO12OHSiOB23222 白白色色扇扇形形苦苦酮酮酸酸 H+（二）（二） 沉淀反应沉淀反应 PbSNaSVitBAcPbNaOH OHNHAgNOAgCl白白3HNO HNO蓝蓝淀淀粉粉试试纸纸 KIMnOCl H S元素反应元素反应Cl-反应反应（三）（三） 其他反应其他反应三、三、 含量测定含量测定 HClOClOBHClOHClClBAcHg）（喹那啶红亚甲蓝喹那啶红亚甲蓝 （

17、紫红（紫红天蓝）天蓝）（一）（一）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 ml/mg.nMcT861622733710 %WFTVV% 空空样样含量含量UV法法（二）（二）片剂、注射剂片剂、注射剂= 421%cmE11（每片）相当于标示量的（每片）相当于标示量的%=%WEA%cm100110011 标示量标示量平均片重平均片重稀释度稀释度A = ECL规格规格g/片片g/100ml稀释度稀释度稀释倍数稀释倍数1 gChP（每（每ml）相当于标示量的）相当于标示量的%=%VEA%cm1001110011 标示量标示量稀释度稀释度规格规格g/mlml准确度高准确度高灵敏度低灵敏度低操作繁琐操作繁琐设备简单设

18、备简单（三）（三） 硅钨酸重量法硅钨酸重量法1、OHHClOHWOOHSiOOSClNHCOHWOSiOHClOSClNHCH 白白）（）（2、1939022347927337221.MMVitB 沉淀沉淀换算因数换算因数 硅硅钨钨酸酸）（硅硅钨钨酸酸VitBVitB2337.273479.22 取本品约取本品约50mg，精密称定，加水，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立，煮沸，立即滴加硅钨酸试液即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸，继续煮沸2分分钟，用钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（沉淀先用煮沸的盐酸溶液（120）

19、20ml分次洗涤，再用水分次洗涤，再用水10ml洗涤洗涤1次，次，最后用丙酮洗涤最后用丙酮洗涤2次，每次次，每次5ml，在，在80干燥至恒重，精密称定，所得重干燥至恒重，精密称定，所得重量与量与0.1939相乘，即得相乘，即得3、例例 精密称取本品精密称取本品0.0519g，加水，加水50 ml溶解，加盐酸溶解，加盐酸2ml煮沸，立即滴加煮沸，立即滴加硅钨酸试液硅钨酸试液4 ml，继续煮沸，继续煮沸2分钟，用分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（先用煮沸的盐酸溶液（120）20 ml 分次洗涤，再用水分次洗涤，再用水10ml 洗涤洗涤1次，后次

20、，后用丙酮洗涤用丙酮洗涤2次，每次次，每次5ml。在。在80干干燥至恒重，称得沉淀重量为燥至恒重，称得沉淀重量为0.2557g。求本品的含量按干燥品计算为多少？求本品的含量按干燥品计算为多少？(本品干燥失重项下测定结果为本品干燥失重项下测定结果为3.73%)%W.W%VitB1001193901 ）水分水分（样样沉淀沉淀%.%.%VitB29910073310519019390255701 ）（A. 取样量取样量50mg 提高灵敏度提高灵敏度B. 80 保持保持4个个H2OC. HCl 增大沉淀颗粒增大沉淀颗粒D. 硅钨酸硅钨酸 ：VitB1 = 8 ：1 使沉淀完全使沉淀完全E. 硅钨酸边搅

21、拌边缓慢加入硅钨酸边搅拌边缓慢加入 增大沉淀颗粒增大沉淀颗粒4、荧荧光光硫硫色色素素异异丁丁醇醇铁铁氰氰化化钾钾 VitBNaOH（四）（四） 硫色素荧光法硫色素荧光法1、激发波长激发波长365nm发射波长发射波长435nm2、+ NaOH + 铁氰化钾铁氰化钾 + 异丁醇异丁醇+ NaOH + 异丁醇异丁醇+ NaOH + 铁氰化钾铁氰化钾 + 异丁醇异丁醇+ NaOH + 异丁醇异丁醇SdAb%WWdSbA%VitB1001 稀稀释释度度稀稀释释度度样样对对对照液对照液供试液供试液3、（1）灵敏度高，线性范围宽）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于）代谢产物不干扰，适用于 体液

22、分析体液分析 维生素维生素C654321OOHHOO C OHHCH2OHL抗坏血酸抗坏血酸两个手性碳原子，两个手性碳原子，有四个光学异构体有四个光学异构体二烯醇强还原性二烯醇强还原性弱酸性（一元酸）弱酸性（一元酸）1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性结构与性质结构与性质一、一、（一）（一）溶解性溶解性O二烯醇结构二烯醇结构二酮基结构二酮基结构二烯醇结构二烯醇结构（二）（二） 强还原性强还原性OHOHCCOOCCCH2OHOOOO C OHHCH2OHCHHOCHOHCOCOCOONa HH+OH-有活性有活性有活性有活性无活性无活性OHOO C OHHCH2OHHOO显显色色

23、糠糠醛醛衍衍生生物物糠糠醛醛酚酚类类脱脱水水 H糖类的显色反应糖类的显色反应蓝蓝色色糠糠醛醛吡吡咯咯脱脱水水 HVitC50结构与糖类相似结构与糖类相似（三）（三）具糖的性质具糖的性质OOHHOO C OHHCH2OH123456C3OH的的pKa = 4.17C2OH的的pKa = 11.57酸性酸性（四）（四）一元酸一元酸OOHHOO C OHHCH2OH123456L(+)抗坏血酸抗坏血酸活性最强活性最强手性手性C（C4、C5）（五）（五） 光学活性光学活性*与碱反应与碱反应单钠盐单钠盐32CONa酮酮酸酸盐盐水水解解 NaOH（六）（六） 水解反应水解反应OHOO C OHHCH2OH

24、HOOHOO C OHHCH2OHNaOCOONaOCOCCHOHHOCHCH2OHNa2CO3NaOHnmnmmaxOHmaxH （七）（七） UV特征特征去去氢氢抗抗坏坏血血酸酸OVitC与氧化剂的反应与氧化剂的反应（一）（一）鉴别试验鉴别试验二、二、OHOO C OHHCH2OHHOCH2OHOOOO C OHH O（银镜）（银镜）黑黑 AgAgNOVitC1、与、与AgNO3反应反应2、与、与2，6 - 二氯靛酚反应二氯靛酚反应(ChP2000)无无色色二二氯氯靛靛酚酚， VitC62氧化型氧化型玫瑰红色玫瑰红色 H还原型还原型蓝色蓝色 OHOH(ChP2000)NClHOClONCl

25、HOClOHH（玫瑰色）玫瑰色）（无色）（无色）红红碱碱性性酒酒石石酸酸铜铜 OCuVitC3、与碱性酒石酸铜反应、与碱性酒石酸铜反应USP4、与、与KMnO4反应反应 MnKMnOVitC糖类的反应糖类的反应（二）（二）蓝蓝色色糠糠醛醛戊戊糖糖脱脱水水三三氯氯醋醋酸酸 VitC或盐酸或盐酸50吡咯吡咯USPOO C OHHCH2OHHOOHCH2OHOO C OHHHHOOCCOHO OCHOH3CH2OHH2O-CO2-H2OOCHN（蓝色）（蓝色）OCHO(糠醛糠醛)OCHOH3CH2OHCH（戊糖）（戊糖）NNH50(吡咯吡咯)UV（三）（三）BP0.01mol/L HClnmmax2

26、43 58554511E%cm IIVitCH去去氢氢抗抗坏坏血血酸酸2指示剂指示剂 淀粉指示液淀粉指示液原理原理1、碘量法碘量法（一）（一）含量测定含量测定三、三、OO C OHHOOCH2OHHI2+OHOO C OHHCH2OHHOH+ I 取本品约取本品约0.2g，精密称定，加新，精密称定，加新沸过的冷水沸过的冷水100ml与稀醋酸与稀醋酸10ml使溶使溶解，加淀粉指示液解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴，立即用碘滴定液（定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝）滴定，至溶液显蓝色，在色，在30秒内不褪。每秒内不褪。每1ml碘滴定液碘滴定液(0.1mol/L)相当于相当于8.806mg

27、的的C6H8O6方法方法2、）（ml/mg.nMCT806821317610 IIVitCH去去氢氢抗抗坏坏血血酸酸2（1）酸性环境）酸性环境 d . HCl （2）新沸冷）新沸冷H2O减慢减慢VitC被被O2氧化速度氧化速度讨论讨论4、（3）立即滴定）立即滴定 赶走水中赶走水中O2减少减少O2的干扰的干扰（4）附加剂干扰的排除）附加剂干扰的排除片剂片剂 滑石粉滑石粉 过滤过滤注射剂注射剂 抗氧剂抗氧剂 丙酮丙酮甲醛甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 CHHOOaS3a S O+H2N H ON2252HO NH COS3a33COCHCH33CHCHCNaSO3O

28、H33CHCHCNaSO3OH2，6 - 二氯靛酚钠滴定法法二氯靛酚钠滴定法法（二）（二）酚酚亚亚胺胺二二氯氯靛靛酚酚， VitCUSPJP原理原理1、空空样样二氯靛酚液二氯靛酚液空白空白样品样品VVHAcHPO 3自身指示终点法自身指示终点法蓝蓝色色玫玫瑰瑰红红 OHH无无色色还还原原 方法方法2、（2）快速滴定）快速滴定 2min内内 （1）酸性环境）酸性环境 HPO3-HAc 稳定稳定VitC防止其他还原性物质干扰防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定）剩余比色测定 AVitC测测二二氯氯靛靛酚酚 （定量过量）（定量过量）（测剩余染料）（测剩余染料）讨论讨论3、（4）缺点）缺点 需经常

29、标定需经常标定贮存贮存一周一周不稳定不稳定干扰多干扰多 氧化力较强氧化力较强HPLC法法（三）（三）1、HPLC的优点的优点灵敏度高灵敏度高选择性高选择性高分离分析同步分离分析同步微量分析微量分析干扰少干扰少 快速快速2、HPLC法分离法分离VitC常用方法及测常用方法及测 定对象定对象 对象对象 制剂、生物样品、果汁制剂、生物样品、果汁方法方法 离子交换色谱法离子交换色谱法 离子对色谱法离子对色谱法 分配色谱法（正、反相）分配色谱法（正、反相）血、尿、组织、细胞等血、尿、组织、细胞等例例多种维生素片中多种维生素片中VitA、 VitB1、 VitB2 、VitB6 、烟酰胺、烟酰胺、VitC

30、、VitE的含量测定的含量测定色谱柱色谱柱 ODS流动相流动相 A、水、水 -甲醇（甲醇（4 ：1） B、甲醇、甲醇 （梯度洗脱）（梯度洗脱）抗氧剂抗氧剂 二巯基丙烷磺酸钠二巯基丙烷磺酸钠水溶性维生素水溶性维生素 离子对色谱法（樟脑磺酸）离子对色谱法（樟脑磺酸） 内标法内标法 + 校正因子校正因子 内标物内标物苯酚苯酚脂溶性维生素脂溶性维生素 外标法外标法维生素维生素DHOHHCH2CH3HHHCH3CH3CH3CH3维生素维生素D2一、结构与性质一、结构与性质HOHHCH2CH3HHCH3CH3CH3维生素维生素D3开环的甾体开环的甾体：具有甾类化合物的显色反：具有甾类化合物的显色反应，可用

31、于鉴别。应，可用于鉴别。手性碳原子手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。：具有旋光性，可用于鉴别。多烯多烯：可进行紫外检测。：可进行紫外检测。二、鉴别试验二、鉴别试验1. 显色反应显色反应醋酐醋酐-硫酸反应硫酸反应 D2 黄黄 红红 紫紫 绿绿 D3 黄黄 红红 紫、蓝绿紫、蓝绿 绿绿 三氯化锑反应三氯化锑反应 橙红色渐变粉红橙红色渐变粉红三氯化铁反应三氯化铁反应 橙黄色橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色绿色2. 比旋度鉴别比旋度鉴别维生素维生素D D2 2维生素维生素D D3 3溶溶 剂剂 浓浓 度度 比旋度值比旋度值无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇40mg/ml40mg/m

32、l5mg/ml5mg/ml+102.5+102.5+107.5+107.5 +105+105+112+112注意事项注意事项：应于容器开启：应于容器开启3030分钟内取样，分钟内取样， 在溶液配制后在溶液配制后3030分钟内测定。分钟内测定。 3.3.区别反应：区别反应： 以以96%96%乙醇为溶剂，加乙醇和乙醇为溶剂，加乙醇和85%85%硫酸，硫酸，D D2 2显红色，在显红色，在570nm570nm处有最大吸收，处有最大吸收，D D3 3显黄色，显黄色，在在495nm495nm处有最大吸收。处有最大吸收。 4.4.其他方法其他方法： TLCTLC、HPLCHPLC、制备衍生物测熔点、制备衍

33、生物测熔点三、杂质检查三、杂质检查维生素维生素D D2 2中麦角甾醇的检查中麦角甾醇的检查：加洋地：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置黄皂苷溶液，混合，放置18h18h不得发不得发生浑浊或沉淀。生浑浊或沉淀。前维生素前维生素D D的光照产物的光照产物四、含量测定方法四、含量测定方法 中国药典（中国药典（20002000年版）采用年版）采用正相高效液相色谱法正相高效液相色谱法测定维生素测定维生素D D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法三个方法。固定相：硅胶固定相：硅胶流动相：正己烷流动相：正己烷- -正戊醇（

34、正戊醇（997997：3 3）第一法第一法：用于无维生素：用于无维生素A A醇及其它杂质的干扰的情况，醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下：步骤如下：1 1系统适用性试验：测定重复性和分离度。系统适用性试验：测定重复性和分离度。Vit D3对 照 品前 Vit D3反 式 Vit DVit D3速 甾 醇 DVit D3重 复 性前 Vit D3与 反 式 Vit D3Vit D3与 速 甾 醇 D3901h254nm365nmHPLC冷 却 环 己 烷R大 于 1.0RSD小 于 2.0%峰 ：峰峰33 2 2测定校正因子：测定校正因子： A A S S /m /m S S f f1 1 =

35、- = - A A r r /m /m r r f f2 2 = =（A A S S m m r r- f- f1 1 m m S S A A r1r1）/ /（A A r1 r1 m m S S） 3 3含量测定：含量测定： m mi i= =（f f1 1 A Ai1i1+ f + f 2 2 A A i2i2）m m S S /A /A S S第二法第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：1 1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙 醚、制备供试液醚、制备供试液A A。2 2净化：供试液净化：供试液A

36、A经液相色谱分离，准确收集含有维经液相色谱分离，准确收集含有维 生素生素D D及前维生素及前维生素D D混合物的全部流出液，制混合物的全部流出液，制 备成供试液备成供试液B B。 固定相：固定相：ODSODS 流动相：甲醇流动相：甲醇- -乙腈乙腈- -水（水（5050：5050：2 2） 3 3含量测定：取供试液含量测定：取供试液B B按第一法测定。按第一法测定。第三法第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：步骤如下：1 1制备供试液：取供试液制备供试液：取供试液A A，净化，水浴加热，得供，净化，水浴加热，得供 试液试液C C。

37、制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。2 2含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样 对照液和供试液，按外标法定量。对照液和供试液，按外标法定量。苯并二氢吡喃醇苯并二氢吡喃醇维生素维生素EOHO苯环苯环 + + 二氢吡喃环二氢吡喃环 + + 饱和烃链饱和烃链OR1HOR2CH3名名 称称R1R2相对活性相对活性-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*（天然品）（天然品） （合成品）（合成品）CH3COOCH3CH3CH3CH3CH3CH

38、3H3CH3COdl生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯结构与性质结构与性质一、一、苯环苯环 + 二氢吡喃环二氢吡喃环 + 饱和烃链饱和烃链1、易溶于有机溶剂，不溶于水、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键、酯键 易水解易水解 OorOHHVitE醌型化合物醌型化合物生育酚生育酚OHNO3VitE生生育育红红生生育育酚酚7515（一）（一）硝酸反应硝酸反应橙红色橙红色鉴别鉴别二、二、OOCH3C16H33H3CCH3O（橙红色）（橙红色）生育红生育红CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚HNO3强氧化剂强氧化剂 取本品约取本品约30mg，加无水乙，加无水乙醇醇10ml溶解后，加硝酸溶解

39、后，加硝酸2ml，摇匀，在摇匀，在75加热加热15分钟，溶分钟，溶液应显橙红色。液应显橙红色。三氯化铁联吡啶反应三氯化铁联吡啶反应红色红色生育醌生育醌对对生育酚生育酚联吡啶联吡啶 2FeKOHFeVitE3O（二）（二）OOH3CCH3OHCH3C16H33CH3CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚对对-生育醌生育醌+3FeO弱氧化弱氧化剂剂红色红色+23Fe3+2FeNNNN = 41.045.5%cmE11max = 284nmmin = 254nm0.01%无水乙醇中无水乙醇中UV法法（三）（三）维生素维生素EUV图图薄层板薄层板 硅胶硅胶G展开剂展开剂 环己烷环己烷

40、-乙醚（乙醚（4 ：1）显色剂显色剂 硫酸（硫酸（105 5） VitE Rf = 0.7TLC法法（四）（四）硫酸铈滴定液（硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄二苯胺（亮黄灰紫）灰紫）生生育育醌醌对对生生育育酚酚 3422CeCe 利用游离生育酚的还原性，利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈将硫酸铈还原成硫酸亚铈 检查检查 三、三、原理原理（一）（一）试剂试剂（二）（二）nCMT （M生育酚生育酚= 430.8）（ml/mg154. 228 .43001. 0T 例例 取本品取本品0.10g，加无水乙醇，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液溶解后，加二苯胺试液1滴，滴，用

41、硫酸铈液（用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，）滴定，消耗硫酸铈液（消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不）不得过得过 1.0ml。%100WTV% 限限量量2.15%15. 2%1001 . 0002154. 00 . 1% 限量限量限量限量（三）（三）药典规定药典规定消耗硫酸铈液（消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml设：应消耗硫酸铈液设：应消耗硫酸铈液 V ml0.011.0 实际浓度实际浓度 V硫酸铈实际浓度硫酸铈实际浓度）（0 . 101. 0mlV 若硫酸铈液浓度不是若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量应重新计算硫酸铈的消耗量）（）（ml.ml

42、V98001020001010 四、四、 含量测定含量测定GC法法（一）（一）1、选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高速度快速度快分离效能好分离效能好挥发性低、不挥发性低、不稳定、极性强稳定、极性强衍生化易受衍生化易受样品蒸气压限样品蒸气压限制制载气载气N2固定液固定液硅酮（硅酮（OV-17）担体担体硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱温柱温265检测器检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标内标正三十二烷正三十二烷 n 500 R2VitE测定的色谱条件测定的色谱条件2、内标法加校正因子内标法加校正因子内标法内标法供试液（样品供试液（样品+内标）内标）内标物内标物对照液（对照对照液（对照+内标）内标）是样品中不存在的物质是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近与被测组分峰靠近能与各组分完全分离能与各组分完全分离与被测组分的量接近与被测组分的量接近对样内对内样样样内内对对内内相对mmAA