苔藓植物对重金属污染的响应机理和生物指示的研究

1、苔藓植物对重金属污染的响应机理和生物指示的研究摘要随着人类活动对环境干扰程度的日益加剧，利用生物对环境污染进行指示和检测成为当前对环境生物学研究的热点之一。苔藓植物作为一类良好的指示植物，被世界各国广泛应用为环境污染和变化的指示生物。但有关苔藓植物对环境污染的响应及机理研究仅有少数研究和报道。本论文在成功利用组培技术大量扩繁小立碗藓、细叶小羽藓和葡枝青藓配子体的基础上，采用先进的同步辐射荧光分析技术和生理生化测定分析，开展了组培条件下试管内苔藓植物的重金属胁迫实验，深入研究了重金属胁迫下种藓类植物的重金属及营养元素的积累规律及其生理生化响应，探讨藓类植物对环境污染的响应机理及其生物指示作用。主

2、要的研究结果如下：（1）在大量的比较实验基础上，系统完成了细叶小羽藓和葡枝青藓的组培研究工作并建立了两种藓类配子体植株高效的人工快繁系统。研究发现，对于两种藓类植物配子体在试管内快繁而言，基本培养基的组成、培养基中外源蔗糖浓度、激素条件以及培养瓶内外状况都会对试管内生长的配子体产生重要影响。本研究最终确定的两种藓类配子体试管内快繁的最佳条件是：改良的基本培养基添加的蔗糖；值调整在至；培养瓶内空气相对湿度保持在至之间；培养瓶要具有适度的透气性；培养温度为±；光照时间为；光照强度为至。上述相关研究成果获得了项国家发明专利的授权，同时获得了重金属胁迫实验所需的两种藓类配子体材料。上海师范大

3、学博士学位论文体对元素累积能力和吸收敏感性都非常强，其植株体中的元素含量适合于作为评估环境污染程度的量化指标。同样的比较分析表明，细叶小羽藓对元素和元素的累积能力和吸收敏感性都很强，其配子体内元素和元素的含量适合于作为这指示环境中两种重金属污染的量化指标。重金属复合胁迫对藓类配子体中重金属的累积能力有显著影响。以与形成的三种不同重金属复合污染处理时发现，较低浓度的对三种藓类吸收均具有强烈的拮抗作用，在很大程度上缓解了此三类重金属对藓类的毒害作用。采用微探针扫描分析技术研究了配子体茎叶中重金属元素微区分布，在组织和细胞水平上揭示了藓类植物茎叶吸收累积重金属的机制。同时，进一步证实，供试三种藓类均

4、具有强烈的重金属累积能力和敏感的生物响应特性，可作为监测环境重金属污染的生物指示植物。（2）深入分析了重金属胁迫对藓类植物营养元素吸收的影响。结果表明，一定浓度的重金属离子对配子体生长所需的多种营养元素的吸收产生拮抗作用并抑制配子体对营养元素的吸收利用。在重金属单一污染条件下，随着污染浓度的增高，供试三种藓类植物配子体中营养元素的累积量呈现出两种变化趋势。第一种是营养元素累积量先升高后降低，即低污染浓度的重金属促进了藓类配子体中营养元素的累积，而过高污染浓度则会降低元素的累积量。第二种是营养元素累积量随污染浓度增高呈直接下降趋势。重金属种类不同，藓种不同，配子体中各种营养元素吸收和累积的受抑制

5、强度不同。供试的四种重金属离子污染下，细叶小羽藓配子体中六种营养元素的最大降幅均低于小立碗藓，表明细叶小羽藓对上述种重金属污染的耐受性都很强，最适合于作为环境重金属污染长期监测的指示植物。污染下，在最低污染浓度和最短污染时间的处理组，匐枝青藓配子体中六种营养元素的含量就表现出显著的变化。说明匐枝青藓植株对铅污染产生的营养元素累积响应非常快速，适合作为铅污染的指示植物。在污染浓度至污染浓度之间，匐枝青藓配子体中四种元素含量与污染浓度之间均呈现显著线性回归关系。说明在供试污染浓度范围内，污染浓度与匐枝青藓配子体中四种营养元素含量之间存在剂量效应关系，建议利用匐枝青藓中的这四种营养元素含量作为监测环

6、境重金属污染（3）通过组培条件下的重金属胁迫实验，运用技术，测定分析了不同浓度等重金属离子单一或复合胁迫下，种藓类的重金属元素的积累规律。单一重金属污染时，随着重金属离子污染浓度的增高，配子体中相应重金属元素的累积量呈现显著增高趋势。藓类植物种类不同，其配子体对重金属的累积能力和吸收敏感性也有差异。供试三种藓类比较，匐枝青藓植株上海师范大学博士学位论文摘要的辅助生理指标。不同种类重金属复合胁迫对于配子体不同种类营养元素吸收和累积表现出三种不同的胁迫效应，一种是缓解累积抑制效应，一种是增强累积抑制效应，一种是显著促进累积效应。（4）采用生理生化分析方法，测定分析了不同重金属胁迫下种藓类植物的生理

7、响应和变化。结果表明，三种供试藓类总叶绿素含量对重金属污染的生物响应均非常快速，说明三种藓类植物对重金属污染反映敏感，适合于作为指示重金属污染的指示生物。污染导致三种藓类叶绿素的降低幅度最大，说明叶绿素含量的降低是污染导致植物光合作用受抑制的重要原因之一。不同种类单一重金属污染胁迫下，三种藓类植物酶活性响应表现出两种变化规律，一种是随着重金属污染浓度的增高，酶活性逐渐增强；一种是重金属低污染浓度范围内，酶活性逐渐增强，当污染浓度较高时，酶活性显著较低。供试三种藓类的酶活性与重金属污染浓度之间以及含量与重金属污染浓度均存在显著的剂量效应关系，可以拟合形成曲线回归关系显著的函数方程，因此建议将苔藓

8、的酶活性和含量作为监测环境重金属污染的辅助生理指标进行推广应用。综上所述，本研究在分析种藓类植物对重金属污染响应的基础上，进一步证明苔藓植物是作为环境重金属污染的敏感的良好的指示植物，为进一步利用苔藓植物监测和指示环境污染和变化提供了科学依据。关键词：苔藓植物，组织培养，重金属累积，营养元素累积，生理响应，环境指示研究目的意义及内容针对苔藓植物对环境污染的响应及机理研究较为薄弱，本论文研究中，在完成和获得种藓类植物组培扩繁的配子体材料的基础上，开展组培条件下的重金属污染胁迫试验，并采用先进的同步辐射技术测定分析了藓类配子体中多种元素的含量及其在茎叶中的微区分布规律，在组织及细胞层面探讨苔藓植物

9、对重金属污染物吸收累积机制，为利用苔藓植物监测环境重金属污染提供科学依据。同时，应用生理生化分析的技术方法，探讨和分析苔藓植物对重金属污染的生理响应及其对环境指示的意义。研究结果可为深入了解苔藓植物对环境污染的响应及指示作用，进一步科学筛选适合于环境指示的苔藓种类及相应的生理生化指示指标，以及更好地推广应用苔藓植物指示环境质量和变化提供科学依据和相应的技术。本论文的主要研究内容包括：（1）在试管内大量扩繁实验室原有的小立碗藓组培配子体材料的基础上，再新建立种藓类植物细叶小羽藓和匐枝青藓的组培快繁系统，并在试管内扩繁获得大量生长一致的配子体材料用于重金属污染胁迫试验。（2）在组培条件下，开展种藓

10、类植物试管小生境内的重金属污染胁迫试验。（3）采用基于同步辐射光源的射线荧光分析方法测定不同种类重金属污染胁迫下的种藓类配子体中相应重金属元素和主要营养元素的含量，以此为基础分析探讨苔藓植物对重金属污染的生物响应机理。（4）应用基于同步辐射光源的的荧光微探针扫描分析技术测定和分析重金属元素在苔藓植物茎叶中的吸收累积途径和微区分布特性，在组织及细胞层面探讨苔藓植物对重金属污染物吸收累积机制。（5）用生理生化分析方法，分析测定重金属污染胁迫下的苔藓植物种生理生化指标的的变化，包括光合色素含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，以此为基础分别从苔藓植物光合作用特性、重金属胁迫的适应性及膜脂过氧化损伤程度三

11、个方面探讨苔藓植物对重金属污染的响应机制；筛选与重金属污染程度具有相关性的生理指标用于环境重金属污染的长期监测。苔藓植物对生态环境的巨大作用是随着全球生态环境问题的日益严重及相关研究的深入才被人类逐渐认识的。与其他植物种类相比，苔藓植物对生态环境变化具有较高敏感性，是公认的优良生物指示物; 另一方面，苔藓植物的“拓荒形象”、可观的生物量和净生产量也不容忽视，因而其在全球生态系统 C /N循环、气候变迁，以及水土保持等方面也具有重要的作用。但是对苔藓植物的研究与其他高等植物相比起步较晚，关于其在生态系统中功能的系统研究还相当薄弱，生态环境变化对苔藓植物生态系统影响的研究更是不足。而且，目前研究所

12、涉及的领域也比较窄主要是泥炭地，涉及的苔藓植物种类也很少主要是泥炭藓和模式植物小立碗藓( Physcomitrella patens) ，国内关于苔藓 植 物 生 态环境作用研究的学者更是寥寥无几，与西方国家的研究水平还存在着较大差距。随着人类活动对全球生态环境的影响，生物( 尤其是人类和植物) 的生存空间受到了严重的破坏，如何利用植物准确便捷的对环境污染和全球生态变化进行指示和监测已成为当前全球生态环境研究的热点问题之一。然而，由于对苔藓植物重视程度不够，导致大量稀有苔藓物种的灭绝以及生物多样性的减少，2004 年通过的中国首批濒危苔藓植物红色名录已达82 种。深入调查，建立全球苔藓植物多样

13、性数据库和空间分布图，研究植被破坏与恢复过程中苔藓植物群落的演替，预测植被和环境的变化发展方向，加大对苔藓植物物种多样性的保护迫在眉睫。有关苔藓植物生态环境功能的研究还有待探讨与完善，综合生理生态学、生物化学、分子生态学、遥感等多门学科的研究方法与手段，深入探讨其作用规律与机理。 第六章苔藓植物对重金属污染的生理响应和生物指示作用引言当植物暴露于重金属污染环境之中时，悬浮于空气中的重金属微粒会沉积于植物体上，形成一层阻绝层，会严重减少植物细胞内叶绿素对日光的捕捉和吸收，从而降低了光合速率，引起植物体生长不良。当重金属污染物被吸收到植物体内并富集累积至一定浓度之后，植物体会遭受严重的化学毒害作用

14、。最常见的毒害作用是引起叶绿素的降解，叶片出现褐化，白化，黑斑，蔫黄等症状（方炎明等，），影响植物的光合作用（龚双姣等，）、呼吸作用，破坏细胞膜结构，并对植物细胞的遗传物质产生危害。很多重金属都被证实能直接或者间接地通过形成活性氧，使植物体内产生氧化胁迫，导致细胞膜脂质的过氧化，蛋白质、色素、酶、核酸等的氧化损伤，严重者可致使植物死亡（刘素纯等，）。关于植物对重金属污染的生物响应和生物指示作用这方面的工作，国外有学者已做过较多的研究，但多以种子植物为实验材料，且大多是针对农作物。而国内以苔藓植物为研究对象开展相关研究工作的实验室很少。本文分别以组培扩繁的小立碗藓、细叶小羽藓和匐枝青藓配子体为试

15、验材料，在试管内采用单一重金属污染液进行污染处理，研究苔藓植物对重金属污染的生物响应及其生物指示作用，旨在为利用藓类植物监测环境重金属污染提供科学依据。试验材料与方法试验材料试管内旺盛生长且生长一致的小立碗藓、细叶小羽藓和匐枝青藓配子体。试验方法单一重金属污染试验设计供试的四种重金属离子分别为单一重金属离子污染浓度。试管内生长的三种藓类重金属污染处理方法无菌条件下，向长有生长旺盛且长势均一的藓类配子体的培养瓶内加入含不同浓度的单一、和的污染液，在固体培养基表面形成约厚的污染液层，浸泡三种藓类配子体基部茎叶。培养天，然后取样，以蒸馏水处理作为空白对照，进行生理指标测定。苔藓植物光合色素含量的。测

16、定方法按照方法原理，采用分光光度法测定，以乙醇作为提取剂郝建军等，。苔藓植物过氧化物酶活性的测定方法采用愈创木酚比色法测定郝建军等，。精确称取藓类配子体克加磷酸二氢钾，在冰浴中研磨成匀浆。离心分钟。将上清液用滴管吸出，即为酶液。保存在冰箱中。一个反应混合液磷酸二氢钾作为对照。另一个反应混合液酶液。在波长下测量值，每隔秒读数一次读数。苔藓植物丙二醛含量的测定方法采用二硫代巴比妥酸显色法测定（王学奎，）。精确称取克，加的三氯乙酸和少量石英砂，研磨成匀浆后，再加，进一步研磨，最后加，倒入离心管。离心分钟。上清液硫代巴比妥酸，混匀，沸水浴分钟。（对照：蒸馏水硫代巴比妥酸），迅速冷却后，再离心分钟。取上

17、清液在和波长下比色，测定吸光值。利用公式：，进行计算，再根据物质含量物质浓度提取液体积稀释倍数样品鲜重，算出可溶性糖和丙二醛的含量。（：可溶性糖浓度；：丙二醛浓度）数据处理本章数据均采用次重复实验的平均值±标准差的形式，苔藓植物的各项生理指标的含量均以配子体鲜重表示。原始数据处理和数据的统计分析使用国际标准统计软件进行。制图采用软件完成。讨论与总结植物叶绿素含量和光合作用对各种不同重金属的响应是有差异的，但总体规律表现为随着重金属污染胁迫浓度的升高，叶绿素含量的总体水平降低陈国祥等，；江行玉等，；代林全，。徐燕云等对不同浓度胁迫后大灰藓总叶绿素含量进行测定分析，结果显示，在低浓度胁迫

18、下，总叶绿素含量不降反升。当浓度为时总叶绿素含量开始下降徐燕云等，。本实验结果也证实了此种现象的存在。在供试最低污染浓度胁迫下，细叶小羽藓和匐枝青藓中总叶绿素含量显著高于对照组；在最低污染浓度胁迫下，细叶小羽藓的总叶绿素也显著高于对照组。等研究表明，处于正常环境下的植株体一旦遭遇污染胁迫，机体的器官组织、细胞及细胞内酶系等不同层面上会立即做出应激反应。应激反应的产生可能预示着植物对污染胁迫的生物响应比较迅速。据王泽港等报道，、和可引起水稻叶片叶绿素含量降低，其中以的作用最为明显王泽港，骆剑峰，。比较本实验供试的四种重金属引起三种藓类植物总叶绿素含量下降的幅度发现，也是的作用最为明显，其次为，然

19、后是，最后是。依据总叶绿素含量降低速率和降低幅度进行比较，本实验供试的三种藓类植物对四种重金属的耐受性由强到弱顺序是：匐枝青藓细叶小羽藓小立碗藓。李荣春李荣春，的研究表明，高剂量的会扰乱光化学合成和电子传递的初始反应，使根和茎的生长受到阻碍。杨丹慧的研究表明，等重金属离子对高等植物叶绿体的光合电子传递有抑制作用，而且通常光合系统的活性对重金属离子更为敏感杨丹慧，。的研究认为重金属使高等植物的叶绿体含量明显降低的原因是重金属离子直接干扰了叶绿素的生物合成，。由此可见，重金属对光合作用的抑制是其对光合器官结构的破坏以及对叶绿素合成有关酶系统和电子传递的共同影响造成的。本实验研究发现，虽然污染与其他

20、三种重金属污染比较，对三种藓类植物总叶绿素含量下降的影响最小，但其导致三种藓类叶绿素的降低幅度最大。小立碗藓、细叶小羽藓和匐枝青藓的叶绿素的最大降幅分别为、和。植物细胞中叶绿素全部属于捕光色素，位于光合膜上，负责吸收光能，并将吸收的光能传递到反应中心色素。叶绿素含量的降低将会大大降低光能吸收和传递的速率，从而降低光合效率。由此可见，叶绿素含量的降低是污染导致植物光合作用的抑制的重要原因之一。重金属胁迫与其他形式的氧化胁迫相似，能导致大量的活性氧自由基产生自由基能损伤细胞内主要的生物大分子，同时引起膜脂过氧化。植物细胞中有多种抗氧化防御系统能够清除自由基保护细胞免受氧化胁迫的伤害.也是植物忍耐重

21、金属胁迫的主要机理之一。重金属胁迫能诱导植物组织中总活性升高，这是植物对所有污染胁迫的共同响应。在适应胁迫中的作用是把转化为和的有效酶，因此人们建议植物组织中活性水平的变化可作为反应污染胁迫的灵敏指标。本实验研究证实，供试三种藓类的酶活性与重金属污染浓度的关系可以拟合形成曲线回归关系显著的函数方程表，二者存在显著的剂量效应关系，因而建议将苔藓的酶活性作为监测环境重金属污染的辅助生理指标进行推广应用。总结利用生物对环境污染进行指示和检测是当前环境生物学研究领域的研究热点之一。苔藓植物作为一类良好的指示植物，被世界各国广泛应用为环境污染和变化的指示生物。但有关苔藓植物对环境污染的响应及机理研究仅有

22、少数研究和报道。本论文在成功利用组培技术大量扩繁小立碗藓、细叶小羽藓和葡枝青藓（1）配子体的基础上，采用先进的同步辐射荧光分析技术和生理生化测定分析，开展了组培条件下试管内苔藓植物的重金属胁迫实验，深入研究了重金属胁迫下种藓类植物的重金属及营养元素的积累规律及其生理生化响应，探讨藓类植物对环境污染的响应机理及其生物指示作用。（2）采用生理生化分析方法，测定分析了不同重金属胁迫下，种藓类植物的生理响应和变化，包括光合色素含量变化，过氧化酶（活性变化，丙二醛（含量变化。结果表明，三种供试藓类总叶绿素含量对重金属污染的生物响应均非常快速，说明藓类植物对重金属污染反映敏感，适合于作为指示重金属污染的指

23、示生物。主要创新点（1）利用自主建立的藓类植物试管小生境内重金属污染胁迫试验体系进行苔藓植物对重金属污染胁迫的响应及其机制的研究。先进的同步辐射技术在试验中的应用。（2）为进一步推广应用苔藓植物监测和指示环境重金属污染的变化，利用分布广泛、适应性强、且符合作为环境污染指示植物特征的细叶小羽藓和匐枝青藓作为供试材料，通过污染胁迫试验筛选出适宜的生理生化指标作为指示环境重金属污染的辅助监测指标。研究展望（1）作为一种生物监测方法，利用苔藓植物监测环境重金属污染，近年来，在国内外已开展了大量研究并已得到广泛推广应用。但目前对苔藓生物监测方法的研究和应用主要集中在以生态法或化学分析法监测大气重金属污染

24、，而关于苔藓植物对于环境重金属污染的响应及机理和生物指示等方面的研究尚处于起步阶段。本文选择了试管内生长的三种藓类植物的配子体，利用四种重金属元素、和作为污染物开展了苔藓植物对于环境重金属污染的响应及机理研究，运用技术，测定分析了不同浓度，等重金属离子单一或复合胁迫下，种藓类的重金属元素和营养元素的积累规律，采用微探针扫描分析技术研究了配子体茎叶中重金属元素微区分布特征，采用生理生化分析方法，测定分析了不同重金属胁迫下，种藓类植物的生理响上海师范大学博士学位论文第七章总结与展望应和变化。关于三种藓类植物对重金属污染的响应及机理和生物指示方面的研究取得了一些成果，但对其他重金属和非金属污染物以及多种重金属复合污染下，苔藓植物所产生生物响应及机理还需进一步研究。（2）本研究结果表明，重金属污染条件下，藓类植物的多种生理指标的变化都与单一重金属污染浓度之间具有剂量效应关系，因而可作为监测环境重金属污染