肠道致病菌的分离与鉴定

1、肠道致病菌的分离与鉴定1、 实验目的（1）掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤（2）掌握平板划线分离法（3）掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义2、 实验材料（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培育基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培育基（EMB）、克氏双糖铁培育基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培育基、蛋白胨水、半固体培育基3、 实验流程 （1）肠道致病菌的分离 待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培育基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。 细菌的分离接种：

2、用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯四周进行划线分离法接种细菌于EMB培育基。将培育基置于37培育1824小时。（2）肠道致病菌的纯化 单菌落接种：从已培育待测细菌的EMB培育基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培育基上，一部分直接深化培育基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37培育1824小时。 待测细菌的初步推断：取出已纯化培育待测细菌的KIA培育基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。（3）肠道致病菌的鉴定 生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应布满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培育的KIA培育基上的培育物接种于各发酵管，

3、将各发酵管于37培育1824小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） 动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培育基上的培育物分别接种于蛋白胨水、尿素培育基、半固体培育基中，将各个培育基于37培育1824小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培育基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） 血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培育基上的培育物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在其次格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻

4、摇动玻片，经12min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯四周进行实验操作。4、 实验结果与分析（1） EMB培育基现象与分析： 培育基下部呈现黑色现象，上部培育基仍为红色，培育基斜面有细菌明显集中生长。 分析：培育基下部消失黑色现象，说明该细菌能够分解培育基中的物质并产出硫化氢气体，由于培育基中含铁，因而硫化氢能够与其结合成硫化铁，消失黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥发，只有少部分能够与少量铁结合，故产生的现象不明显，上部仍呈现红色。（2）生化鉴定现象与分析： 葡萄糖发酵管：管内培育基指示剂由紫色变成

5、黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。分析：培育基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解葡萄糖并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色转变。 乳糖发酵管：管内培育基指示剂颜色不发生转变，仍为紫色，有明显细菌生长现象，无气泡产生。分析：培育基指示剂不发生颜色转变，说明该细菌能分解乳糖但不能产酸也不产气，使得管内指示剂无明显现象。 甘露醇发酵管：管内培育基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。分析：培育基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解甘露醇并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色转变。（3）动力检查现象与分析： 尿素培育基：管内培育基指示剂颜色无

6、明显变化，但有明显气泡产生，有明显细菌生长现象。分析：管内培育基指示剂无明显颜色转变，说明该细菌不能分解尿素，但培育基中其他物质成分可以使细菌分解产气，因而产生气泡。 蛋白胨水：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌生长现象，无气泡产生。加入靛基质（吲哚）试剂后不消失玫瑰红色。分析：加入靛基质指示剂后不呈现玫瑰红色，说明该细菌不能分解培育基中的色氨酸产生靛基质，因而靛基质指示剂不能与之发生化学反应，消失颜色变化。 半固体培育基：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌沿穿刺线集中生长现象，无气泡产生。分析：细菌能够沿穿刺线生长，说明该细菌有鞭毛，能运动，有助于鉴别细菌种类。（4）血清学鉴定现象与分析

7、： 现象：通过玻片两边对比，在加有伤寒杆菌诊断血清的其次个格子中周围液体清亮，有明显凝集现象；另一格液体表面浑浊，无凝集现象。 分析：其次格中加入伤寒杆菌诊断血清消失凝集现象，说明接种细菌应为伤寒杆菌，二者特异性结合产生抗原抗体复合物，因而呈现凝集现象；而第一格中未加入伤寒杆菌诊断血清，接种细菌无相应抗体，不能产生抗原抗体复合物，所以不呈现凝集现象。综上：葡萄糖甘露醇乳糖靛基质硫化氢尿素分解动力现象由此推断：该细菌应为乙型副伤寒杆菌。5、 实验总结本次实验所需材料较多，实验流程较简单，需要动手操作的步骤较频繁，因而在实验过程中需要多加注意操作方法。 在实验进行前应生疏掌握实验的操作步骤及流程，了解实验操作的方法，以便实验的顺利进行。 实验应在无菌操作下进行，如可在燃烧的酒精灯四周进行细菌接种（注意酒精灯平安，切勿灼烧自己或是实验仪器，防止事故的发生）。 细菌的培育应在适宜的环境下进行，避开外界环境影响细菌的生长繁殖（由于实验室已配备培育箱，故消失问题不大，由于实验室操作者较多，须做好相应的标记）。 从EMB中