在大鼠普通体外循环基础上建立心麻液停跳模型

1、1心麻液心脏停跳在大鼠体外循环模型上所致的心肌损伤研究朱斌 Mihai V . Podgoreanu， G. Burkhard Mackensen ，叶铁虎 黄宇光 作者单位： 100730中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院麻醉科（朱斌 叶铁虎 黄宇光）；27710 美国杜克大学医学中心麻醉科 （ Mihai V. Podgoreanu ，G. Burkhard Mackensen ）.摘要目的 在大鼠普通体外循环 （CPB）模型基础上，建立起灌注心停跳液心脏停跳（CA）模 型，比较 CA模型与普通 CPB 模型实验大鼠心肌缺血再灌注损伤的区别；并观察 CA 模型大 鼠术后的存活和

2、恢复情况。方法借助血管穿刺置管技术，在大鼠普通 CPB 模型基础上，通过 右侧颈总动脉置入双腔气囊导管，充气套囊、阻断升主动脉、灌注心脏停跳液使心脏停搏。比较 CPB 模型大鼠（n=6）和 CA 模型大鼠（n=15）心肌缺血再灌注损伤的区别；并分别在术 后一天、一周和两周三个时点观察CA 模型大鼠恢复情况（n=5 ）。结果 CA 大鼠在心脏缺血再灌注 60 分钟后， HFABP 和 cTnI 明显高于术前基础值和普通 CPB 组水平，在复灌后 3 小时 达到顶峰，术后一天降低，在术后一周和两周的观察时点回降至术前水平。左室射血分数在 两组动物之间差别不大；E/A比值在 CPB 后降低， 而在

3、CA 后进一步下降。 CA 组大鼠均存活， 但术后体重明显降低，在术后一周时最为显著，两周时大鼠体重已经恢复，并且超过术前水 平。 结论 本实验在普通的 CPB 模型基础上成功的建立了 CA 模型。同普通 CPB 模型大鼠相 比， CA 模型大鼠在体外循环心脏缺血再灌注后，出现了明显的心肌损伤。CA 大鼠具有较高的存活率和与临床类似的恢复过程。关键词 心脏手术；体外循环；心脏停跳；缺血再灌注，心肌The myocardial injury following cardioplegic arrest on general cardiopulmonarybypass rat modelZHU Bi

4、n*, Mihai V. Podgoreanu, G. Burkhard Mackensen, YE Tie-hu*. HUANGYuguang*. * Department of Anesthesiology, Peking Union Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China.Abstract Objective To establish cardioplegic arrest（CA）on the basis of general cardiopulmonary bypass（CPB） rat model; to compare th

5、e myocardial ischemia-reperfusion injury related to CA and CPB and toobserve the survival and the recovery of CA rats. Methods A double-lumen balloon catheter was cannulatedthrough the right common carotid artery into the ascending aortic artery. The cardioplegic arrest was achievedby intraaortic cl

6、amping through balloon inflation and by cardioplegia infusion. To compare the myocardialischemia-reperfusion injury related to CA and CPB and respectively observe the survival and the recovery ofCA rats at one day, one week and two weeks after cardioplegic arrest. Results At sixty minutes after card

7、iacarrest, HFABP and cTnI were significantly released compared with baseline and the rats on CPB group,reached peak value at three hours after reperfusion, reduced one day operatively and returned to theirbaseline levels at one and two week time points. Left ventricular ejection fraction didn t show

8、 obviouschange between CA andCPB group; yet E/A ratio was reduced after CPB and further reduced after CA. All the rats survived thecardioplegic arrest with significant body weight loss one day and one week postoperatively but fully recoveredtwo weeks after surgery. Conclusions The cardioplegic arres

9、t was successfully established on the generalCPB rat model. CA rats showed significant myocardial injury but presented a satisfactory survival rate andrecovery after the global myocardial ischemia-reperfusion injury.Key words Cardiac surgery; cardiopulmonary bypass; cardioplegic arrest; ischemia-rep

10、erfusion,myocardium尽管外科手术、麻醉、体外循环以及围术期心肌保护方法已经取得了很大的进步，但是 心脏手术术后心2肌梗死（ myocardial infarction, MI ）的发病率仍处于较高水平： 7-19%1-2； 而 这又直接影响到病人术后的短期和长期生存率3-4。心脏手术后 MI 可能是多因素的综合结果，如：直接外科手术操作引起的创伤、心脏停跳复跳的心肌缺血再灌注损伤以及体外循环 （ cardiopulmonarybypass, CPB ）的全身影响等5。目前模拟心脏手术的实验模型多局限在大动 物，而与大动物相比，大鼠相对廉价、易存活，而且大鼠实验不需要复杂的“团

11、队”参与， 因此模拟心脏手术的大鼠 CPB 模型则具有经济、可重复性强等优势。本实验室和其他一些研究者已经成功在大鼠上建立起了普通 CPB 模型6-9。和临床心脏手 术实际相比，这些模型最突出的一个问题是不能利用停跳液使大鼠心脏停跳。Gmz in ger 等曾尝试直接阻断主动脉并灌注停跳液，大鼠心脏成功被停跳10。但是由于研究者是在正中开胸和双侧颈总动脉置管结扎前提下进行的实验，实验大鼠理论上讲术后没有存活的可能。本研究拟以血管穿刺置管技术，在大鼠普通 CPB 模型基础上，通过右侧颈总动脉置入双 腔气囊导管建立起灌注心停跳液心脏停跳模型（Cardioplegic Arrest，CA），以比较

12、CA 与 CPB心肌缺血再灌注损伤的区别；并观察 CA 模型大鼠的存活情况。材料与方法本动物实验经过杜克大学动物委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于使用实验室 动物的相关规定（ No. 86-23, revised 1996 ）。雄性 Sprague-Dawley 大鼠（鼠龄 14-16 周，体重 400-450 克，购于 Harlan, Indianapolis, IN, USA ），禁食 12-16 小时， 自由饮水。 于术日晨以 5% 异氟烷吸入诱导麻醉后， 行经口气管内插管， 接呼吸机型行机械通气，吸入 50%空 -氧混合气，调整潮气量和呼吸频率，以确保呼气末二氧化碳（PECO2）

13、在 32-42mmHg 之间。在以下的外科准备期间， 持续吸入 2%异氟烷维持麻醉。 将针型 YSI 552 体温计 （YSI Temperature, Dayton, OH, USA）置于大鼠头部皮下进行持续体温监测。其余手术操作遵循无菌操作原则，手术区域 以 1%利多卡因浸润。在显微镜下共进行五支血管的穿刺置管。以聚乙烯导管（PE-10）置入腹壁尾侧浅动脉行持续动脉压监测；以 24 号静脉留置套管针套管进行腹壁尾侧浅静脉穿刺置 管，建立起输液给药静脉途径并予以肝素 400 IU/kg ；以 20 号静脉留置套管针进行大鼠腹侧尾 动脉穿刺置管，作为 CPB动脉回流管道； 通过右侧颈外静脉置入

14、 4.5F 多孔套管 （改制于 4.5 French Desilets-Hoffman 儿科引导管， CookInc., Bloomington, IN, USA） ，其尖端至右心房水平， 作为 CPB 静脉流出通道。多孔导管位置通过超声定位（ Sonos 7500, Phillips Medical Systems, Andover, MA, USA ）。通过右侧颈总动脉插入球囊直径3.5mm 的双腔球囊扩张导管（SprinterOTW, Medtronic Inc, Minneapolis, MN, USA） 至大鼠升主动脉。 利用超声定位， 确保导管尖端距 离主动脉瓣 0.25-0.35

15、cm，见图 1。所有置管用丝线原位固定防止滑脱或进气。在外科准备完 成后，测量动脉血气和心功能基础值，并抽取血液标本，低温离心后-80C冰箱保存，用以测量心肌损伤指标（ cTnI 和 HFABP ）。CPB 管道包括一个特制的容积为8ml 的静脉贮血器，蠕动泵（Masterflex, Cole-Parmer仪器公司 , Vernon Hills, IL,US） ，流量探测器（ 2N806 流量探头和 T208 流量计 ; Transonics Systems, Inc,Ithaca, NY ,US）,特制膜氧合器（Jostra AG, Hirrlingen, Germany）,预充量 4ml,

16、气体 交换面积 558cm2。上述各部分以 1.6mm 内径无菌硅胶管连接。整个 CPB 管道预充 9ml6%羟乙基淀粉胶体溶液，CPB 流量维持在于大鼠正常心输出量水平：160-180ml/kg/min11。CPB 动脉灌注温度通过变温水浴系统进行调解。外科准备和CPB 管道连接情况见图 2。实验分为两部分：第一部分，在普通CPB 模型基础上建立停跳液心脏停跳模型（CA），并比较 CPB 模型大鼠（n=6）和 CA 模型大鼠（n=15）心肌缺血再灌注损伤的区别；第二部分，分 别在术后一天、一周和两周三个时点观察CA 模型大鼠恢复情况（n=5 ）。所有实验大鼠在开始体外循环前，静脉途径予以肝素

17、400 IU/kg、芬太尼 25 卩 g/kg 泮库溴铵 0.2 mg/kg，并将吸入异氟烷浓度降低至 1%。将呼吸频率减半，CPB 模型组大鼠在整个 CPB 过程中维持该呼吸频率的3机械通气，CPB 气体流量根据血气结果调整，CPB 持续 75 分钟。CA 模型大鼠在 CPB 开始后降温，15 分钟后，大鼠体温接近 33C，充气升主动脉内双腔球囊扩张导管套囊，阻断升主动脉， 通过导管中心管腔灌注氧合含血冷心脏停跳液2ml。停跳液成份包括：三份氧合血液、一份艾司洛尔（10mg/ml）和两份冷晶体停跳液 （5%葡萄糖、0.225%氯化钠、95mEq/L 氯化钾、238mL/L 三羟甲基氨基甲烷、

18、 枸橼酸盐磷酸盐右旋糖液 60mL/L ）。通过心电图和实时经胸超声证实心脏 停止搏动。当成功建立 CA 后，完全停止机械通气。本实验心脏停跳时间为45 分钟，在停跳至25分钟时， 追加1.5m I氧合含血冷心脏停跳液， 其间如果超声监测发现心脏有跳动迹象随时追 加停跳液0.5ml。CA 组大鼠术中如果出现不能停跳或停跳后提前复跳，则视为该例失败。大鼠 在 CA35 分钟时开始复温，心脏停跳 45 分钟后，套囊放气，重新恢复心脏血供。CA 期间持续静脉输注去甲肾上腺素维持平均动脉血压不低于40mmHg , CA 后持续输注肾上腺素以利于心脏复跳，如果动物出现明显代谢性酸中毒（BE-6 ）,给予

19、碳酸氢钠纠正。 CA 组大鼠在复跳后继续 CPB15 分钟。所有实验动物在 CPB 后都顺利脱机，恢复正常机械通气。CPB 管道中剩余血液常温下以 3000 转/每分钟离心 2-3 分钟以浓缩预充所致的血液稀释，将浓缩所得红细胞缓慢回输给实验大鼠。逐步退出所有血管置管，并结扎相应血管及缝合伤口。约90 分钟后大鼠麻醉后苏醒、恢复自主呼吸并拔除气管插管。密切观察两组动物麻醉复苏活动情况，两组实验大鼠 全部存活，于手术第二日将动物送回动物房饲养，CA 模型组大鼠分别观察一天、一周和两周三个时点（n=5 ）。所有实验动物持续监测体温、动脉血压、CPB 流量。分别在 CPB 前、CPB15 分钟、CA

20、5分钟（CPB20 分钟）、CA20 分钟（CPB35 分钟）、CA45 分钟（CPB60 分钟）、复灌 5 分钟（CPB65 分钟）以及复灌后 60 分钟测定动脉血气（GEM Premier 3000 血气分析仪，Instrumentation Laboratory, Lexington,MA, US）。记录两组实验动物去甲肾上腺素、肾上腺素和碳酸氢钠用量。心肌肌钙蛋白 I （cardiac troponin I , cTnl）是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有较高的心肌特异性及敏感度，已越来越多地用于诊断心肌梗死。心型脂肪酸结合蛋白（heart-typefatty acid bindi

21、ng prote in, HFABP） 是位于心肌细胞内的可溶性蛋白，心肌损伤后可迅速漏出到血液而被检测出，因而可以用于早期监测心肌损伤。本研究分别利用大鼠HFABP ELISA 试剂盒 （Life Diagnostics Inc. West Chester, PA, USA） 和大鼠高敏感 cTnl ELISA 试剂盒 （Life Diagnostics Inc. WestChester, PA, USA）测定 CPB 前和复灌 60 分钟后的 cTnl 和 HFABP 水平。本研究中，二维彩色多普勒超声心动图仪（So nos 7500, Phillips Medical Systems,

22、An dover,MA, US ）除用于静脉流出管道和升主动脉内双腔球囊扩张导管定位外，还分别在 CPB 前和复灌 60 分钟后测定左室射血分数和舒张早期血流峰值/舒张晚期血流峰值比值（E/A 比值）以评估大鼠心功能状况。所使用超声探头为S12 新生儿 5-12 MHz 心脏相位排列探头。在获取图像即刻，暂停机械通气。对于 CA 模型组大鼠，分别在术后一天、一周和两周三个时点（n=5）测量大鼠体重，了解手术创伤后恢复情况。在异氟烷麻醉诱导下完成气管插管行机械通气。超声测量大鼠心脏 左室短轴缩短率（fraction shortening , FS）。利用血管穿刺置管技术完成尾动脉和右侧股动脉 置

23、管以测定动脉血压和获取测量心肌损伤指标的血液标本。在完成相关指标测量后，处死实 验大鼠。资料以均数土标准差（X_S）表示，应用 Spss 10.0 软件进行处理和统计分析，不同时点间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD 检验（Least-significant Differenee，最小显著差值法）；CPB 组与 CA 组之间比较用成组 t 检验。P40mmHg 的较 低水平，明显低于基础值和普通CPB 组，但是复温复灌后，血压保持在CPB 前水平，与 CPB组接近。 CA 组大鼠 CBP 流量在心脏停跳阶段明显高于基础值和普通 CPB 组。 pH 在两组动物 之间变化相似，在复灌或CP

24、B 后期都较术前值有所降低。PaC02 和 SaO2 在手术前后都保持在正常范围。 血钾浓度在 CA 组复灌后有一过性显著升高， 但是仍保持在临床正常范围内。 乳 酸浓度在 CA组动物心脏缺血开始后升高而同时碱剩余降低。 血红蛋白浓度在两组大鼠变化类 似，在 CPB 后都存在一定程度的稀释。 CPB 组大鼠不需要使用血管活性药物和碳酸氢钠；而 CA 组大鼠必须使用去甲肾上腺素（平均用量50-100 卩 g）、肾上腺素（平均用量 80-150 卩 g）和 5%碳酸氢钠（平均用量 0.6-1.2ml）才可以维持合适的血压和血气。2 CPB 组和 CA 组大鼠心肌损伤程度和心功能比较CA 大鼠在心脏

25、缺血再灌注 60 分钟后， HFABP 和 cTnI 明显高于术前基础值和普通 CPB 组水平。左室射血分数在两组动物之间差别不大； E/A 比值在 CPB 后降低，而在 CA 后进一 步下降，见表 2。3 CA 组大鼠在术后存活和恢复情况在 CA 组， 所有成功进行心脏停跳的实验大鼠均存活。 术后体重明显降低， 在术后一周时 最为显著，两周时大鼠体重已经恢复，并且超过术前水平，见表3。 CA 组大鼠在心脏缺血再灌注 60 分钟后， cTnI 和 HFABP 显著升高， 3 小时达到顶峰，术后一天降低，但是 cTnI 仍显 著高于术前值， 在术后一周和两周的观察时点， cTnI 和 HFABP

26、 降低至术前水平， 见图 3。 CA 组大鼠心脏左室短轴缩短率在心肌缺血再灌注 60 分钟后，显著升高，在术后 3 小时和一天仍 高于术前，在术后一周和两周的观察时点，FS 降低至术前水平，见图 4。讨论本研究在普通的 CPB 模型基础上成功的建立了 CA 模型。同普通 CPB 模型大鼠相比， CA 模型大鼠在体外循环心脏缺血再灌注后，出现了明显的心肌损伤；尽管左室EF 与单纯 CPB相比变化不大， 但舒张功能显著降低。 由于所有 CA 模型大鼠在心脏停跳期间和复灌后先后或 同时输注了去甲肾上腺素和肾上腺素，测量所得的心脏功能指标可能难以真实反映受试大鼠 当时的实际心功能状况。 所有 CA 大

27、鼠均成功存活至实验所需的观察时点。 心脏缺血再灌注损 伤所释放的心肌酶在术后一天后逐渐恢复回落， 1 周后恢复正常， 而实验大鼠体重在术后明显 降低，一周时最为显著，两周时大鼠体重已经恢复，并且超过术前水平。同普通 CPB 相比，本模型的关键在于如何利用超声定位确保升主动脉内双腔球囊扩张导 管尖端的准确位置。本实验表明，当导管尖端距离主动脉瓣0.25-0.35 厘米时，灌注停跳液可以获得较好的心脏停搏效果。位置过深、距离过短时，在球囊充气后，导管尖端可能“滑” 向左心室，此时灌注 2ml 停跳液非但不能使心脏停搏，反而可能因过度扩张左心室导致心肌 损伤。位置过浅、距离过长时，充气球囊部分可能位

28、于头臂干内因而难以完全封堵升主动脉， 即使灌注过量的停跳液也难以获得良好的心脏停搏效果。因导管位置不佳而导致的心脏停搏 不能是本 CA 模型失败的主要原因，即便受试动物不因此死亡，但是失去了继续实验的意义。 在本实验室，因为这类问题而放弃的体重在 400-450 克之间的 SD 大鼠接近10%。由于本大鼠 CA 模型在最大限度上模拟了心脏手术和体外循环所造成的心肌缺血再灌注 损伤，而且实验动物具有较高的存活率和与临床类似的恢复过程，这为研究心脏手术术后的 心肌梗死病理生理机制和心肌保护策略提供了优异且经济的动物模型。参考文献1.Mangano DT. Effects of acadesine

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36、im)CA20mi n(CPB40rrn)CA45min(CPB60rrm)R 5minR 60mi nT (C)CPB36.0.534仕 0.433.仕 0.432.仕 0.334.仕 0.4 36.仕 0.736.仕 0.7CA36.仕 0.534仕 0.433.仕 0.332.仕 0.334.仕 0.535.仕 0.535.仕 0.4MAPCBP618621565146113691066136211(mmHg) CA6266016*416*468*4975796112CPBflowCPBCA17 吐 1117 吐 13*178 14*180 1217 吐 11ml/kg/min172 1

37、119 吐 15203 14200 11 17712pHCPB7.520.077.440.097.4 仕 0.09 7.460.047.430.04 7.40.027.420.。6CA7.5 牡 0.03 7.460.107.5 仕 0.08 7.510.087.510.077.4 仕 0.147.410.04PaCO2CPB382398406417415436427(mmHg) CA426365414394403423415SaO2CPB100 仕 010(仕 010(仕 0991100 010 吐 010(仕 0(%)CA990.910(仕 010(仕 0100 0100 010 吐 0991+KCPB4.450.34.410.44.5 仕 0.54.490.54.520.54.5 仕 0.5 4.510.4(mmol/L)CA4.540.34.320.34.