2022年美国及欧洲药典系统适应性要求

1、系统适应性美国药典系统适应性是气相和液相色谱分析方法的重要组成局部，用于证明色谱系统的别离度和重现性能满足样品的分析要求。测试基于这样的原理：仪器、电路、方法和样品组成一个整体系统，我们可以对这个系统进展测试评估。影响色谱系统的因素包括：l 流动相的组成、离子强度、温度和pH值l 柱子大小、流速、柱温和压力l 固定相特点，包括填料类型，载体形状、粒径、孔径、外表积等。l 常用固定相为反相硅胶，以十八碳烷基健合硅胶最常用，其它经过化学修饰的硅胶也有使用。别离度Rs是理论塔板数n的函数也叫柱效，是别离因子，k是容量因子所有符号的意义见前文“色谱定义和说明局部。在规定的色谱条件下，n表示洗脱物中相邻

2、化合物的别离程度，可作为衡量色谱系统柱效能的指标，但是不如直接测试的结果可靠。峰的锋利程度局部反映柱效，这个参数对检查微量物质至关重要。标准品或者标准溶液需要重复进样以确保精细度。除非个论中有规定, 系统适用性五针的数据的相对标准偏差不超过2.0%, 如果超过2.0%的话, 需要进样六针。在含量测定中，如果纯品含量100%，那么相对标准偏差没有最大值限制，这个值可根据屡次进样对照溶液来计算：%RSD=KB/t90%，n-1K为常数0.349，由公式k=(0.6/)(t90%,5/)计算得来，表示B=1.0时六次进样的相对标准偏差。B是个案中规定的上限。n是对照溶液的进样次数3n6，t90%,n

3、-1是自由度为n-1、置信水平为90%，双侧检验时的t值。除非另有规定，RSD不能超过下表中的值。此规定不适用于相关物质检测。Relative Standard Deviation Requirents进样次数3456B%RSD上限2.00.410.590.730.852.50.520.740.921.063.00.620.891.101.27对称因子AS，用于衡量峰的对称性，完全对称时值为1。拖尾越严重，AS的值越大见图4。偶尔也会有值小于1的情况。如果对称因子与1的差值越大，那么积分的精细度越差。信噪比S/N是系统适应性的一个重要参数，计算公式如下图5：S/N = 2H/hH是峰高，即峰最

4、高点到基线的距离；h是噪音最大值和最小值之间的差值。系统适应性测试的数据通过重复进样标准品或者特定文件中规定的对照溶液而得到，此文件中对相关参数的定义同样适用于其它操作条件，以下情况可做相应调整：l 标准品包括参考物质对适应性测试中的所有化合物均适用l 在系统适应性测试中为改良色谱系统性能而作适当调整对色谱系统的调整不能弥补柱子和系统本身的缺陷。为满足系统适应性要求而对分析方法调整时，除非另有规定，以下每个变量的最大值都应考虑；这些调整需要附加有效数据。为验证新方法的系统适应性，需要对改变条件后的分析方法重新评价。多处改动会对系统性能产生积累效果，在分析之前能仔细考虑。在梯度洗脱中不推荐改变流

5、动性组成，如果必须改变，那么只对溶剂体积或滞后体积改变。流动相pHHPLC：在配备流动相时，水相缓冲液的pH波动范围在正负0.2个单位缓冲液盐浓度HPLC：在满足pH值条件下，缓冲液中盐的浓度波动范围在10%。流动相的组成HPLC：以下调整限度适用于流动相中的小组分比例小于等于50%。这些组分的量可在正负30%范围内调整。但是不能超过总流动相的10%。下面是两相体系和三相体系组分的调整范围。两相体系：溶剂比为50:50时，50的30%是15%，超过了10%的限度，因此流动相比例只能在40:60到60：40范围内调整。容积比为2：98时，2的30%时0.6%，因此改变范围在1.4：98.6到2.

6、6:97.4三相体系：溶剂比为60:35:5时，第二组分35的30%时10.5%，超过10%的限度，只能在25%到45%的范围内改变。第三组分5的30%是1.5%。加上组分一共同构成洗脱体系。因此三相体系的比例变化范围是50:45:5到70:25:5或者58.5:35:6.5到61.5:35：3.5。紫外-可见光检测器的波长：操作过程中不允许波长有误差，厂家或者其它机构对检测器波长的校正误差不超过3nm。固定相:柱长：可变范围为原柱长的70%柱内径HPLC：如果线速度恒定可做适当调节，见流速项HPLC下.柱内径GC：调整范围为原柱内径的50%薄膜厚度毛细管GC：调整范围为-50%到100%粒径

7、HPLC：填料颗粒尺寸可以减小50%，但是不能增大。粒径GC：在满足色谱系统适应性要求的情况下，粒径由大换小或者由小换大都可以，调料的粒径比率由最大颗粒的直径除以最小颗粒的直径而来。流速GC：流速可调范围在50%流速HPLC；柱子尺寸改变时，流速可由下式计算：F2=F1l2d22/l1d12F1是文件中规定的流速，单位是mL/min，F2是调整后的流速；l1是文件中规定的柱长，l2是使用柱长；d1为文件中规定的柱内径，d2为使用柱内径。流速可变范围是50%。进样体积HPLC：只要满足精细度和检测限，进样体积可以适当减少，但不能增加。进样体积和分流体积GC：检测器和重现性较好时可做适当调整。柱温

8、HPLC：柱温波动范围在10进样口温度GC：可调范围10程序升温GC：温度可做适当改变，需要保持一定温度或者改变到另一温度值时，温度变化做大容许范围是20。除非另有规定，系统适应性参数由待测物峰的数据计算、样品的Rr，RF，tR实测值应与对照品的实测值一致，文件中给的相对保存时间值是为了方便峰的指认，对于相对保存时间没有评判标准。适应性测试时为了确保最终操作结果的有效性。实验过程中为确保系统适应性，进样前应做适当的准备工作。配置待测溶液时，溶液中包括一定量的待测物和一些其它物质如药品辅料或者杂质。当色谱系统有显著变化时，或者要用特殊试剂，那么要重新做系统适应性实验，否那么不能进展样品分析。.欧

9、洲药典2.2.46色谱别离技术色谱别离技术是一种多级别离方法，样品在固定相和流动相之间屡次分配，到达动态平衡。固定相一般是附在硅胶或者其它固体载体上的固体或液体，可填充在层析柱上或铺在薄层版/薄膜上，流动相可以是气体、液体或者超临界流体。别离原理包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等，也可根据样品分子的大小、空间体积、质量等物理化学性质来别离。本章介绍了系统适应性测试涉及的参数定义及计算方法，分析方法和仪器介绍等已分别在以下章节做了介绍:llllll定义下面分别介绍系统适应性和验收标准的相关参数定义。有些仪器的软件系统包含了一些特定参数的计算方法例如性噪比、别离度。操作人员有责任

10、确认该计算方法是否符合欧洲药典要求，如果有差异，应对该方法做适当调整以符合药典规定。色谱图反响检测器的响应信号、洗脱剂浓度或体积与时间的关系等。理想的色谱图是在平稳的基线上各色谱峰彼此别离，呈高斯分布。色谱峰色谱柱中洗脱的单个组分或者未别离的多个组分在检测器上的响应信号，是色谱图的一局部。一般用峰面积、峰高h和半顶峰宽wh、峰高h和峰宽wi等参数来描述色谱峰。高斯峰有如下关系(图2.2.46-1)：wh = 1.18wi保存时间tR组分从进样到出现最大峰所需时间保存体积VR组分从进样到出现最大峰所需的流动相体积，可用保存时间乘以流速F。VR = tR F死时间tM不被固定相滞留的组分，从进样到

11、出现最大峰所需时间死体积VM不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰所需流动相体积。VM = tM F排阻色谱中用Vo表示见下面。保存因子k有时用容量因子k或者分配比Dm表示，计算公式如下：K = = kcKc表示分配常数，也叫平衡分配系数Vs表示固定相体积VM表示流动相体积在色谱系统中某组分的保存因子也可按下式计算：K = 流动相总时间tt，当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需时间图2.2.46-2流动相总体积Vt，当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需流动相体积，可按下式计算Vt = ttF滞留时间t0：当组分粒径大于固定相

12、胶体孔径的最大尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需时间滞留体积V0：当组分粒径大于固定相胶体孔径的最大尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需体积，可按下式计算V0 = t0F分配常数k0：表示排阻色谱中某一组分的洗脱能力，也叫分配系数，可用下式计算：K0 =滞留因子RF：在平面色谱中也叫保存因子Rf，表示组分在板上的点到原点之间的距离与溶剂前沿到原点的距离的比值图2.2.46-3。Rf=B是分析物的移动距离A是溶剂前沿的移动距离塔板数N：可反映柱效，又叫理论塔板数，计算公式如下：N = 5.54()2tR是组分的保存时间，wh是该物质的半顶峰宽色谱柱类型、柱温、流动相以及化合物类型都会影响理论塔

13、板数的值滞后体积D：也叫梯度延迟体积，指从流动相混合点至柱头的系统体积，可用以下方法计算：色谱柱：用适当的毛细管如1 m0.12 mm代替流动相：A相是水，B相是0.1%V/V的丙酮水流速F：能到达足够的反压为准如2ml/min时间minA相体积百分比B相体积百分比0-201000010020-300100检测器：检测波长265 nm记录吸光度到达最大值的50%时的时间t0.5图2.2.45-4D = tDFtD = t0.5-tG，tG预设为20 minF为流速，单位为ml/min对称因子A色谱峰的对称因子图2.2.46-5按下式计算As = W0.05表示在二十分之一峰高处峰宽d表示二十分

14、之一峰高处到峰顶点投射到水平线之间的距离As值为1表示峰绝对对称，大于1那么为拖尾峰，小于1那么为前置峰别离度Rs两组分之间的别离度2.2.46-1计算公式如下Rs = tR2 tR1tR1和tR2是色谱峰的保存时间wh1和wh2是半顶峰宽在定量平面色谱中，用移动距离代替保存时间来计算两组分之间的别离度，计算公式如下：Rs = RF1和RF2是色谱峰的阻滞因子wh1和wh2是半顶峰宽a是溶剂前沿到基线的距离峰谷比p/v做有关物质的系统适应性测试时，如果两峰之间的基线别离效果不好，可以用峰谷比作为评价依据图2.2.46-6。p/v = p/vHp表示基线以上最小峰的最高点到基线的距离Hv表示基线

15、以上最小峰和主峰之间的最低点到基线的距离相对保存因子r相对保存因子的计算公式如下：r = tRi表示待测峰的保存时间tRst表示参照峰的保存时间tM表示滞留时间未调整相对保存因子rG计算公式如下：rG = 除非另有规定，相对保存因子和未调整的相对保存因子的值根本一致在平面色谱中，用滞留因子RFst和RFi代替保存时间tRst和tRi信噪比S/N小的噪音峰会影响定量分析的精细度。信噪比计算公式如下：S/N = H表示组分的峰高，在参比溶液的色谱图中，测量从信号峰的最高点到基线之间的距离。该信号峰的峰宽至少大于半顶峰宽的5倍图2.2.46-7。h表示色谱图中噪音峰的最高点到最低点之间的距离系统重现

16、性系统重复性表示至少连续进样三次后，所得相对标准偏差的百分数。计算公式如下：sr%= yi表示内部标准方法中的峰面积、峰高或者面积比的值表示平均值n表示值的个数系统适应性用于测试的成分应该明确，能满足系统性能和含量测定的要求。系统适应性测试反映了色谱系统的性能，是建立分析方法不可或缺的一局部。柱效、保存因子、别离度、相对保存因子和对称因子等参数用来描述柱子的性能。这些参数可能从以下方面影响色谱行为： 流动相的组成、离子强度、温度和pH值 流速、色谱柱尺寸、柱温和柱压 固定相特性，包括填充剂类型、填充剂粒径、孔径、比外表积 反相材料类型或者对固定相外表进展其它的构造修饰除非另有规定，还需满足以下

17、要求： 在相关物质测定或含量测定中，用于定量的参照色谱峰，其对称因子取值范围必须在0.8到1.5之间 如果某成分的纯度为100%，那么可容许的参比溶液的相对标准偏差最大值计算公式如下：sr%max = K是常数0.349，由公式K = 计算而来，表示当B = 1.0时，六次进样后的相对标准偏差百分数B表示方法中规定的含量上限减去100%n表示进样次数36t90%, n-1表示双侧检验、置信度为90%、自由度为n-1时的t值除非另有规定，可允许的相对标准偏差最大值不能超过下表表2.2.46-1的值，此规定不适用于有关物质测试。表2.2.46-1 重复性要求进样次数3456B%最大容许标准偏差2.

18、00.410.590.730.852.50.520.310921.063.00.620.891.101.27测试有关物质时，定量限度与此表相等或小于表中数值测试员要根据一些致变因素来选择适宜的方案验证色谱系统，以保证在测试过程中色谱系统的适应性不受影响。色谱条件的调整为满足系统适应性，在不对分析方法做根本改变的情况下，可对色谱参数做适当调整。在梯度洗脱时，改变洗脱条件会导致基线漂移，不利于色谱峰的划分识别，甚至会出现假峰和延长洗脱时间。因此要改变梯度洗脱的条件时，需重新验证方法的有效性。系统适应性是定性分析或含量测定结果的有效保障。市售液相色谱柱的固定相材料类型多样，可满足不同色谱行为需要，为

19、满足系统适应性要求，可对色谱条件做适当调整。但是在反相色谱系统中，调整色谱参数不能总是到达既定要求，这时可选择替换色谱柱。网站EDQM上有各种柱子的性能信息，可根据分析需要选择适宜的色谱柱。一般文件会明确规定一些重要参数以满足系统适应性。薄层色谱和纸色谱展开剂的组成：对其中较少的组分，调整范围为相对差值30%或绝对差值2%，可选其中较大的一种，但任何组分的绝对差值不得超过10%。例如含量为10%的组分，按相对差值30%计算其可调范围在7%-13%，按绝对差值2%计算可调范围在8%-12%，固可按相对差值计算的范围来调整。假设一组分含量为5%，按相对差值计算其可调范围在3.5-6.5%，按绝对差

20、值计算其可调范围在3-7%，此时可按绝对差值范围调整，但是改变范围绝对不能超过10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范围在0.2个单位，非离子溶剂可调范围在1个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范围在10%。点样体积：如果薄层板或层析纸的粒度良好2-10m，点样体积可为规定的10-20%液相色谱：等度洗脱流动相组成：对其中较少的组分，调整范围为相对差值30%或绝对差值2%，可选其中较大的一种，但任何组分的绝对差值不得超过10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范围在0.2个单位，非离子溶剂可调范围在1个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范围在10%。流速：一般可在50%范围内调整，如果改用大尺寸的柱

21、子，调整范围可适当加大。色谱柱参数固定相： 不能改变固定相填料类型例如不能用C8柱替换C18柱 粒径：最多可将粒径减小到原来的50%，但是不能增加填料粒径色谱柱尺寸： 长度：可调范围50% 内径：可调范围25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以下公式做适当调整：F2 = F1F1：方法中规定的流速，单位ml/minF2：改变后的流速，单位ml/minl1：方法中规定的柱长，单位mml2：改变后的柱长，单位mmd1：方法中规定的柱内径，单位mmd2：改变后的柱内径，单位mm柱温：10，除非另有说明，操作时的柱温需明确规定检测波长：不能改变进样体积：在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积，但不能

22、增加进样体积液相色谱：梯度洗脱梯度洗脱不像等度洗脱，要改变洗脱条件的话需要慎重考虑流动相：只有在满足以下条件时才可对流动相组成做微小调整： 满足系统适应性要求 主峰的洗脱时间改变范围不超过方法中规定的15% 改变后的流动相洗脱能力不能比方法中规定的差如果改变条件不能满足系统适应性要求，那么需考虑滞留体积和换色谱柱滞留体积：实验仪器的布局能显著改变别离度、保存时间和相对保存时间等。如有此情况，可能是滞留体积过大。在开场梯度洗脱程序之前，会有一段等度洗脱过程。考虑到规定的方法与实际使用方法中的滞留体积有差异，可在等度洗脱时调整开场梯度洗脱的时间。测试员有责任使等度洗脱时间适应所用的分析仪器。如果方

23、法中规定了滞留体积，梯度洗脱的开场时间可根据下面公式换成实际开场时间：tc = t-D：滞留体积，单位mlD0：实际滞留体积，单位mlF：流速，单位ml/min如果没有等度洗脱这个步骤也不影响数据的有效性，那么此步骤可以省略流动相pH，不能改变缓冲液盐浓度：不能改变流速：色谱柱尺寸改变时可改变流速公式见前面色谱柱参数固定相： 不能改变填料类型 不能改变粒径大小色谱柱尺寸： 长度：可调范围70% 内径：可调范围25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以下公式做适当调整：F2 = F1F1：方法中规定的流速，单位ml/minF2：改变后的流速，单位ml/minl1：方法中规定的柱长，单位mml2：改变

24、后的柱长，单位mmd1：方法中规定的柱内径，单位mmd2：改变后的柱内径，单位mm柱温：5，除非另有说明，操作时的柱温需明确规定检测波长：不能改变进样体积：在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积，但不能增加进样体积气相色谱色谱柱参数固定相： 粒径：(填充柱)最多可减少50%，不能增大粒径尺寸 薄膜厚度：(毛细管柱)可调范围从-50%到+100%色谱柱尺寸： 长度：可调范围70% 内径：可调范围50%流速：50%柱温：10%进样体积和分流体积：在满足检测限和重现性的情况下可做适当调整超临界流体色谱流动相组成：填充色谱中，对其中较少的组分，调整范围为相对差值30%或绝对差值2%，可选其中较大的一种，但是毛细管色谱系统不能调整流动相。色谱柱参数固定相：粒径：(填充柱)最多可减少50%，不能增大粒径尺寸色谱柱尺寸：长度：可调范围70%内径：可调范围525%填充柱 可调范围50%毛细管柱流速：一般可在50%范围内调整柱温：5，除非另有说明，操作时的柱温需明确规定进样体积：在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积，但不能增加进样体积定量