实验室常用分子生物学合集--精华版

1、一 细菌相关实验技术1. 细菌分离鉴定1.1沙门氏菌分离鉴定1.1.1 食品样前增菌取检样25g，加入225mL缓冲蛋白胨水于均质杯内。用均质器以8000-10000r/min打碎1min，于36±1培养4h(干蛋品培养1824h)，取 10mL于100mL亚硒酸盐肮氨酸（SC）增菌液内，于36±1培养1824h。1.1.2 食品样细菌分离取增菌液1环，划线接种于DHL琼脂平板，于36±1分别培养1824h(DHL)或4048h(BS)，观察平板上生长的菌落，沙门氏菌、和沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表1。非食品样直接取棉拭子在DHL琼脂平板上划线即可。表1沙门

2、氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌、沙门氏菌（即亚利桑那菌）DHL琼脂无色半透明；产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色a) 生化试验: 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。表2肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种-+/-+沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+/-+沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌-+-沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普

3、罗菲登斯菌属-+-伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+/-大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌说明：在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。在接种三糖铁琼脂的同时，再接种碱性蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1培养1824h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B

4、1，其他5种反应结果均可以排除。表3肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-1反应序号硫化氢靛基质尿素氰化钾赖氨酸判定菌属A1+-+沙门氏菌属A2+-+沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3+-+-弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4+-普通变形杆菌B1-+-沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属B2-+-+-大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3-+/-+-克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4-+/-+-摩根氏菌、普罗菲登斯菌属反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬

5、酸杆菌。表4肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-2尿素氰化钾赖氨酸判定结果-+-+-+甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。表5肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-3甘露醇山梨醇判定结果+-+-沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果）缓慢爱德华氏菌反应序号B1：补做ONPG。ONPG（+）为大肠埃希氏菌，ONPG（-）为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸（+），但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸（-）。1.1.3 沙门氏菌PCR方法鉴定a) 煮沸法提取基因组DNA模板b) 引物

6、设计fliC-1: 5-GGCTATTATGAAGTTTCCGTTG-3fliC-2: 5-GGGCAGAAGTCAGGTTGTTTAC-3sefA-1: 5-AATTGTGCGAATGCTAATAGTTG-3sefA-2: 5-TGATACTGCTGAACGTAGAAGGTC-3c) 反应体系：单重和二重PCR体系的总体积均为30mL，其中包括：1×PCR反应缓冲液，dNTP 0.2mmol/L，引物各25 pmol/L，1.5U Taq plus聚合酶，3uL DNA模板。d) 扩增条件：优化后的PCR反应程序为 94预变性5min，然后进入循环程序：94变性30s，56退火30

7、s，72延伸50s，30个循环； 72继续延伸5min。e) 结果扩增出了622bpfliC基因片段的为鼠伤寒沙门氏菌，扩增出534bp sefA基因片段的为肠炎沙门氏菌。1.2 猪链球菌的分离鉴定PCR方法培养基：1）TSB（Tryptone Soya Broth）选择性平板：4%绵羊血、3%TSB、1.5%琼脂粉及以上三种工作浓度试剂；2）BHI培养基：3%BHI、3%新生牛血清；3）BHI保存液：3%BHI、3%新生牛血清、15%甘油；1.2.1 操作步骤：a) 喉部棉拭采样；b) 接种血平板（只接种一个区域，转动棉拭）；c) 一次性接种环划线（2-3个区域，以期获得分散性较好的菌落）；

8、d) 37培养18-24小时；e) 牙签挑选疑似菌落（溶血、针尖状灰白色菌落）接种于BHI血清培养基，37培养18-24小时；f) 煮沸法取1ML菌液提DNA模板，其余菌液4保存；g) 双重PCR扩增目的基因： 引物：gdh-1： GCTGCGTATTCTGTCAAACG gdh-2： CGATGGACAGATAAAGATGG cps2j-1： TGAGTCCTTATACACCTGTT cps2j-2： AGAAAATTCATATTGTCCACC反应体系与条件：template 3µlddH2O 17µl2.5MdNTP 0.6µl10PCRbuffer 3.0&

9、#181;l25uM gdh primers 1.2µl25uM cps2j primers 2.4µlTap-plus 0.8µl总体积 30µlPCR扩增条件：94 5min，94 1min、50 40s、72 50s进行30循环后，72延伸10min；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像结果中，两条带的为猪链球菌2型，一条带的为猪链球菌，无条带为非猪链球菌；h) 从猪链球菌2型和非2型PCR阳性管重新划线接种于血平板37培养18-24小时，同时接种PCR阳性菌液-80甘油保存，以避免污染风险；g) 镜检观察猪链球菌2型疑似菌落形态特征是否单一；k

10、) 生化鉴定复核；l) 猪链球菌2型和非2型猪链球菌PCR阳性的菌株4保存管重新接种血清BHI，培养至对生长期后离下细菌，以 BHI保存液重悬，置-80保存。1.3副溶血弧菌分离鉴定PCR方法1.3.1 操作步骤a) 以无菌操作取25g或25mL样品，液体摇匀或固体置于灭菌均质袋经搅拌均质器搅拌均匀后加至225mL碱性蛋白胨中，置于37增菌培养8-12h，b) 用接种环取少许培养液到TCBS选择性培养基上培养8-10h，c) 挑取绿色菌落，纯化培养d) 提取DNA模板：取37培养过夜的副溶血弧菌菌液1.5mL加入Eppendorf管中，12000rpm离心1min，弃上清；用灭菌ddH2O悬浮

11、细胞，12000rpm离心1min，弃去上清；加入2×TZ和ddH2O各40µl，充分混匀；-20放置45min;沸水浴10min后冰浴10min； 12000rpm离心1min，收集上清液即为模板DNA。e) 引物设计合成： gyrB-a： CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT gyrB-b： TCCGCTTCGCGCTCATCAATA tlh-a： AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG tlh-b： GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCf) PCR反应体系PCR扩增均在30µL反应体系中进行，每种物质的浓度及加样量如下：10

12、15;PCR buffer 3µl10mM dNTP 0.5µltlh-F(50µmol/L ) 0.5µltlh-R(50µmol/L) 0.5µlgyrB-F(50µmol/L ) 0.5µlgyrB-R(50µmol/L ) 0.5µltemplate 3.3µl2U/µl Taq Plus DNA聚合酶 0.7µlddH2O 20.5µlg) 扩增条件：94 3min；94 1min，58 1min，72 1min，30个循环；72 5min。扩增

13、产物用含0.5g/mL Goldview染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照记录结果。k) 结果：在285bp及450bp处均有特异条带的为副溶血弧菌。1.4 单增李斯特菌的分离鉴定PCR方法 培养基：1）EB1:TSB加萘啶酮酸 (18mg/l), 丫啶黄 (10.8mg/l) 2)EB2 TSB加萘啶酮酸 (16mg/l), 丫啶黄 (20mg/l) 3)李斯特菌选择性培养基 购自科玛嘉公司1.4.1 操作步骤a) 以无菌操作取25g或25mL样品，液体摇匀或固体置于灭菌均质袋经搅拌均质器搅拌均匀后加至225mLEB1增菌液中，置于37预增菌培养4h；b) 将样品转种至EB2

14、增菌液中, 37增菌培养18-24h；c) 用接种环取少许培养液到李斯特菌选择性培养基中培养18-24h；d) 挑取蓝色菌落，纯化培养；e) 煮沸法提取基因组DNA模板；f) PCR检测 PCR扩增均在30µl反应体系中进行，每种物质的浓度及加样量如下：10×PCRbuffer 3µl10mM dNTP 0.5µlLisA(50µmol/L ) 1µlMonoA(50µmol/L) 0.8µlLisB (50µmol/L ) 1µlHA-1(50µmol/L ) 0.6µlH

15、A-2 (50µmol/L ) 0.6µltemplate 3µl2U/µl Taq Plus DNA聚合酶 0.6µlddH2O 18.9µlg) 扩增条件：94 3min；94 1min，62 30sce，72 1min，30个循环；72 8min。扩增产物用含0.5g/mL Goldview染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照记录结果。h) 结果：在720bp及400bp处均有特异条带为单增李斯特菌。2. 细菌冻存2.1甘油冷冻保藏法: 本法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。a) 挑取单菌落，接种

16、于装5mL的15mL离心管中37振荡培养8-12小时，至菌密度OD600为0.8-1.2。b) 按60%甘油：菌液为1：2（V/V）的量加入甘油和菌液分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），混合后，-80保存。甘油量无须精确，终浓度达到15%-30%即可。3药物敏感性试验 原理：各种病原菌对抗生素药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性也有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有效药物，用于临床治疗，对控制细菌传染病的流行至关重要。 材料： 试管、各种细菌、镊子、标签、药敏片，棉试子、各种抗生素3.1检测菌和标准菌的准备按细菌菌量计算标准准备接种菌量。生长后的菌液用MH

17、肉汤矫正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释10倍（含菌量大约107CFU/mL），对生长条件要求较高的细菌,如链球菌属和肠球菌属等细菌需在MH琼脂加5%脱纤维羊血或兔血中进行。稀释后的菌液尽快在15分钟内接种。3.2接种用微量加样器分别取0.18 mL检测菌液到第一排的96孔聚苯乙烯U形微孔板中，其他孔中加0.18mL菌液。最终接种菌量约5*105CFU/mL。加样时加样器吸头必须插到管内面下加菌并注意避免与管内壁接触。3.3加抗菌药物在第一排0.18 毫升检测菌液的孔内分别加入20L相应抗菌药物，混匀。3.4 稀释用微量加样器自第一排吸取100L液体加入第二排，充分混匀后，再自第二排

18、吸取100L液体加入第三排，混匀。以此类推，直至第8排，最后自第8排中吸取100L液体弃去。3.5 37培养14-18h后记录结果无细菌生长的孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。注：质量控制：每批实验时需根据检测菌分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，粪肠球菌ATCC29212，和铜绿假单胞菌ATCC27853，等标准菌株在同一试验条件下进行测定。常用抗菌药物对这些标准菌株的MIC的预期取值范围可参考有关资料判断。超过或低于一个稀释度以上时，应检查出错的原因以及标准菌株被污染或变异的可能性。二 病毒相关实验技术1.病毒分离1.1 粪便样品处理取1g粪便加入9m

19、L RPMI1640培养液混匀后，加入500L氯仿，充分混匀后4000rpm离心15min，取上清过滤除菌，-70保存备用。1.2 病毒分离将处理好的样品按培养液体积的1/10同步接种刚消化分瓶的F81细胞，置37 5CO2中静置培养。每隔12h观察细胞的生长情况。待细胞病变达80以上时刮取细胞并离心收集，培养液重悬后反复冻融三次，12000rpm离心10min，取上清-70保存作为盲传或鉴定用的病毒液。2.病毒鉴定2.1 PCR检测：材料：PCR反应所需试剂（见第三章PCR部分）、加样器、枪头、PCR仪。2.1.1 DNA提取：采用UNIQ-10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒，从病料中提取病毒

20、基因组DNA，具体操作如下：a) 取少量病料放入离心管内，加入300L TE缓冲液混匀，12000rpm离心5min，取上清煮沸10 min，随后冰浴5min；b) 取上清200L至eppendorf管中，依次加入400L DVI Buffer和3L Proteinase K（20mg/mL），混匀，55保温5min；c) 加入260L无水乙醇，混匀，用1-mLTip头将样品全部转移至UNIQ-10柱，柱子放入2mL收集管中，10000rpm室温离心1min；d) 取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，加入500L Wash Solution，10000rpm室温离心1

21、min；e) 重复步骤4）一次；f) 取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，10000rpm室温离心1min，以除去残留的Wash Solution；g) 将UNIQ-10柱子放入一新的eppendorf管中，在柱子中央加20L Elution Buffer，室温放置2min；h) 12000rpm室温离心1min，eppendorf管中的液体即作为PCR反应模板。g) 进行PCR反应（具体操作间分子生物版）2.2 HA-HI试验-血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验 原理：抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互聚集形成肉眼可间的凝集小块或沉淀物，根据

22、是否产生凝集现象来判定相应抗体或抗原。 材料: 孔反应板、移液器、滴头、微型振荡器、生理盐水、0.5%鸡红细胞悬液、病毒液、阳性血清。2.2.1猪红细胞悬液的制备a) 采集健康猪血液置灭菌离心管中，加入2倍体积的生理盐水，2000rpm离心10min，弃上清，反复洗涤3次；b) 用0.02M PBS（pH7.0）重悬，制成10红细胞悬液；c) 缓慢加入等量戊二醛，室温搅拌醛化2-3h至红细胞呈褐色；d) 用0.01M PBS（pH7.0）反复洗涤5次，并配成20红细胞悬液；f) 加入硫酸汞使弃终浓度为0.1%，置于4保存备用。g) 醛化后的红细胞呈咖啡色，形态完好无自凝现象，在蒸馏水中不溶血。

23、2.2.2血凝（HA）试验本试验采用微量法在96孔V形板上进行，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，最后加入等体积红细胞悬液，置于4作用1h，待对照孔红细胞完全沉淀后再读取结果，操作方法见表1。判定标准：红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100凝集(#)、75凝集(+)、50凝集(+)、25凝集(+)。其血凝价（凝集单位）以红细胞100凝集的病毒液的最高稀释倍数表示。表1.血凝试验操作表Table 1 Procedure for hemagglutination test孔号123456789101112病毒液稀释度2122232425262

24、72829210211空白对照0.02M PBS(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05病毒液(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.050.5%红细胞悬液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.2.3 血凝抑制（HI）试验本实验采用抗犬细小病毒单克隆抗体作为血凝抑制的抗体，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，分别加入等体积的病毒液（4个凝集单位）,37作用1h后，最后加入红细胞悬液，置于4作用

25、1h，待抗体对照孔红细胞完全沉淀后再读取结果，操作方法见表2。判定标准：在抗体对照不发生凝集，抗原对照完全凝集的前提下进行判定。红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100凝集(#)、75凝集(+)、50凝集(+)、25凝集(+)。其血凝抑制效价以红细胞凝集完全被抑制的抗体最大稀释倍数表示。表2.血凝抑制试验操作表Table 2 Procedure for hemagglutination inhibition test孔号123456789101112抗体稀释度212223242526272829210抗原对照抗体对照0.02M PBS(mL)0.0

26、50.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05CPV单抗(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.050.054单位病毒液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.0537作用1h0.5%红细胞悬液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.3 间接免疫荧光(IFA)试验 原理：通过荧光素对抗体或者抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应抗原或抗体的方法材料：长满F

27、81的细胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生长液、96孔细胞培养板、加样器、枪头、荧光显微镜、病毒液（PRV）2.3.1 操作步骤a) 将F81细胞以105/mL接种24孔板，500L/孔，并按培养液1/10体积同步接种病毒液，同时设不接毒的细胞孔作为阴性对照；b) 37 5CO2中静置培养24h后，停止培养，用0.02M PBS洗涤三次；c) -20预冷80丙酮溶液固定15min；d) PBS洗涤3次，每次5min；e) 抗CPV单抗作为一抗，用含0.5脱脂奶粉的PBS进行100倍稀释，加入培养孔中（300L/孔），37作用1h；f) PBS洗涤3次，每次5min；g) 每孔加入300L羊抗鼠IgG

28、-FITC（200倍稀释），37避光作用45min；h) PBS洗涤3次，每次5min；i) 50甘油PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。2.4 病毒感染力的滴定（TCID50的测定） 材料： 长满单层的细胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生长液、96孔细胞培养板、加样器、枪头病毒液（PRV）2.4.1：测定病毒感染力的方法：半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue cLture infective dose)：用细胞来检测蚀

29、斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测2.4.2：TCID50的操作步骤a) 在每孔加入细胞悬液90µl，使细胞量达到23×105个/mL。b) 在EP管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-5。c) 将稀释好的病毒接种到24孔培养板中，每一稀释度接种8个空，每孔接种10µl。d) 设正常细胞做阴性对照。e) 3天后做间接免疫荧光。f) 结果按Reed-Muench法计算。三 分子生物学、免疫学及细胞生物学部分1. PCR技术1.1 基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引

30、物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1:模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2:模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3:引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下

31、次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。1.2 PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10L4种dNTP混合物 每个浓度 200umol/l引物 每个浓度10-100pmol模板DNA 0.1-2ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/l加双或三蒸水至 100L 1.3 PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。 a) 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序

32、列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，在特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特条 带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不

33、配对而导致PCR失败。引物中能加上合适的酶切位点，或被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。b) 引物量： 每条引物的浓度0.11umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。c) 酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100L时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。d) dNTP的质

34、量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。e) 模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与

35、否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。e) Mg2+浓度：Mg2+对PC

36、R扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。1.4 PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。a) 温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为10

37、0300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于

38、模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异 性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/

39、S/酶分子 高于90时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。b) 循环次数:循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。2. 重组质粒载体构建载体是携带靶DNA片

40、段进入宿主细胞进行扩增好表达的工具。粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒DNA不但能在细菌中复制，而且在添加真核复制信号好启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒。构建质粒载体及鉴定工作可以分为七步基因组的获取 目的片段的扩增与纯化 目的片段和质粒的双酶切及纯化(确保双酶切的精确性) 目的片段与质粒载体的连接 感受态的制备 转化 重组质粒的鉴定 以下将逐步介绍：2.1 基因组DNA的提取方法（提模板）2.1.1 煮沸法将细菌过夜培养物离心，用灭菌双蒸水洗涤1次200ul，加

41、入40ul等体积灭菌双蒸水和TZ（4% Triton X-100和5.0 mg/mLNaN3溶于pH 8.0 Tris-HCL）重悬，放置-20 0.5h后，沸水浴处理10min，冰浴10min，6000rpm离心3min，收集上清液用于PCR扩增。2.1.2 蛋白酶K法a) 3mL过夜培养物10000rpm离心1min ；b) 弃上清，用500L Solution I重悬c) 加入60L 50mg/mL溶菌酶（因用量比较小，注意将溶菌酶直接称量在EP管内配制。G-菌可适当减少溶菌酶用量），37水浴作用30 min；d) 加入30L 10% SDS和2.5L 20 mg/mL 蛋白酶K，65水

42、浴作用3h（可延长时间，可水浴中过夜）；e) 加入等体积的酚/氯仿异戊醇抽提（1：1，大约各300L），10000rpm离心8min；（此处所指氯仿异戊醇是指氯仿：异戊醇=24：1）f) 取上清，重复3-4次；g) 小心吸取上清，并加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc, 室温沉淀30min；h) 10000rpm离心12min，弃上清；i) 用70%乙醇淋洗沉淀，10000rpm离心8min；j) 37或室温风干沉淀；k) 用20L含10g/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暂离心，调终浓度至约200ug/ml备用。2.1.3 试剂盒法 (见说明书)2.2目的DNA的PCR扩

43、增 (见上叙PCR技术)2.3 目的DNA纯化 (AXYGEN试剂盒割胶回收)2.4 DNA双酶切及双酶切产物纯化 2.4.1 50L 双酶切体系 (以Pst和 Kpn为例 ) 10X M Buffer 5L Pst(10u) 3L Kpn(10u) 3L DNA（PCR纯化产物或者质粒） 10-18L 4-6ug 补加ddH2O至 50L2.4.2 短暂离心，37反应3-5hrs或酶切过夜2.4.3 双酶切产物纯化a) 补加TE溶液至400L；a) 加入等体积的酚/氯仿抽提，12000rpm，4，离心6min；a) 上清加800L无水乙醇及50L 3M NaAc，室温沉淀20min；a) 1

44、2000rpm，4，离心10min；a) 70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm，4，离心10min；a) 烘干沉淀，并用一定量的TE溶解；a)取2L电泳，估计浓度，确定下一步连接需要量。2.5 双片段的连接（用DNA Ligation Kit Ver.2进行）按下面体系依次加入溶液已纯化PCR双酶切产物 A 适量已纯化质粒双酶切产物 B 适量 Sol I 5-10 L (等于A+B总体积) 混匀，短暂离心，16连接过夜。2.6 感受态的制备2.6.1大肠杆菌感受态细胞的制备 (CPG法)a) 取-80冻存的E.coli (JM109、DH5、BL21、CP-RP)菌株，在新鲜的LB平板上划

45、线，37温箱过夜培养；b) 挑取单菌落，接种于5mL试管，37摇床振荡过夜培养；c) 将过夜培养的菌液按1:100接种于一定体积的SOB中，37振荡2-3h至OD600至0.5左右；d) 将细菌移入50mL离心管(预先4°C冰箱制冷)，冰上放置10-15min；e) 4，4500 rpm离心10min，倒扣离心管，去水滴；f) 加入一定量预冷的CPG（每管约2mL，轻轻悬浮；4，4500 rpm，离心10 min；去上清，以预冷CPG悬浮（每50mL菌液加1.5-2mL CPG），0.1-0.2mL分装-80°C冰箱保存;g) 此法可使感受态细胞保持3个月以上的稳定活性。另

46、，分装后在4°C静置6-12h，可提高感受效率3-5倍。2.6.2 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞a) 用接种环蘸取E.coli DH 5菌株，在不含Amp的LB平板上表面划线，37静置过夜；b) 培养16hrs后，从平板上挑取单菌落，接种于5mL 不含Amp的LB液体培养基中，37振荡培养过夜；c) 取1mL 加至100 mL 不含Amp的LB液体培养基中，37振荡培养3-4小时至对数生长期；d) 取20mL培养液，转入预冷50 mL 离心管中冰上放置20min（2管）；e) 4000rpm，4，离心8min；f) 弃上清，倒置离心管，用吸水纸吸干，每管加预冷的5 mL 75m

47、mol/L CaCl2溶液，轻轻吹打，冰上放置20min；g) 2000 rpm，4，离心8min；h) 弃上清，并用预冷的含15%甘油的75mmol/L CaCl2溶液重悬，分装成200L 小份/eppendorf，-70保存。2.7 转化a) 200 L感受态细胞，冰上解冻至刚好融化；b) 取10L 连接反应液，加至感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，冰上放置30min；c) 42热击90sec，马上冰淬灭2min；d) 马上加入LB液体培养基（不含Amp）1mL，混匀，200rpm，37振荡培养45min；f) 6000rpm，室温离心5min，吸去1mL上清，用剩余的200L溶液重新悬浮细

48、菌沉淀；g) 将细菌悬浮液200L涂布到含100g/mL的氨苄平板上，37静置培养过夜；h) 16hrs后，挑单菌落接种与5mL含Amp的LB液体培养基中，37振荡培养过夜。2.8 重组质粒鉴定2.8.1 碱裂解法小量制备质粒DNAa) 取1.5mL细菌培养液于Eppendorf管中，12000rpm，4离心 5min,弃上清；b) 沉淀菌体重悬于100L的SolutionI，振荡混匀，室温放置5min；c) 加入新鲜配制的SolutionII 200L，温和颠倒数次，冰浴5min；d) 加入SolutionIII 150L，上下颠倒混匀，冰浴5min；e) 12000rpm，4离心6min；

49、f) 将水相转入干净的Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀，12000rpm，4离心8min；g) 将水相转入干净的Eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc，振荡混匀，室温放置30min；h) 12000rpm，4离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上吸干；i) 加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm，4离心 8min，弃上清，倒置于吸水纸上吸干液体；37或室温风干沉淀；j) 用20L含10g/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暂离心备用。 2.8.2 双酶切鉴定重组质粒利用外源基因引入的Pst

50、、Kpn酶切位点，对重组质粒进行双酶切鉴定；同时用特异性引物进行PCR鉴定。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并拍照。 3. 重组质粒在大肠杆菌中的表达 基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而产生有重要作用的蛋白产品。基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统，大肠菌表达系统属于原核表达系统3.1重组菌的诱导表达a) 取测序正确的阳性菌以1:100接种于含硫酸卡那霉素的LB培养基，37振荡培养3h（OD600约等于0.5）；b) 加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，培养4h；c) 室温8000rpm离心10min收集菌体；d) 弃上清后加入适量50mM P

51、BS（pH7.4）悬浮细菌，反复吹打后，8000rpm离心10min；e) 弃上清，加入培养基1/10体积的50mM PBS（pH7.4）重悬细菌，取1mL超声波破碎（300 W，4 S/4S，99次）；f) 12000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。3.2 重组蛋白可溶性分析a) SDS-PAGE电泳板的处理 用中性洗涤剂清洗后，再用双蒸水淋洗，然后用酒精棉球擦拭，吹风机吹干备用。b) 15分离胶的制备 在10 mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水 1.1 mL30%丙稀酰胺溶液 2.5 mL1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 mL10% SDS 0.05 mL10%过硫酸铵 0.05 mLTEMED 0.005 mL充分混匀，立即缓慢倒入已固定好的两电泳板之间的狭槽中，马上轻轻覆盖一层双蒸水，室温静置至胶完全聚合，除去上层水相，用滤纸吸干水分。c) 浓缩胶的制备 在10 mL小烧杯中加入下列试剂： 双蒸水 1.4 mL30%丙稀酰胺溶液 0.33 mL1.0 M Tris (p