(整理)利用短片段同源替换SFHR技术进行位点特异修复CHO细胞中游离的.

1、利用短片段同源替换(SFHR技术进行位点特异性修复CHOffl胞中游离的缺陷型EGF厘因生命科学学院00级贺晓路摘要传统的基因治疗主要采用基因扩增(geneaugmentation)的策略,即向细胞中导入正常的靶基因表达序列,补偿细胞中缺陷型靶基因的功能.基因添加策略在遗传疾病的治疗中存在着严重的缺陷,从而限制了其临床应用.近年来开展起来的位点特异性基因修复(Site-specificGeneCorrection)技术,如短片段同源替换技术(SmallDNAFragmentHomologousReplacement,SFHR,克服了基因添加策略的缺点.位点特异性的基因修复技术源于对同源重组(H

2、omologousRecombination)的研究,即通过导入与正常靶基因同源的DNA®片段,通过细胞中的DNA窗复或者同源重组的机制,特异性地修复缺陷型靶基因中的突变.利用位点特异性的基因修复技术不仅可以修复靶基因中存在的突变,而且能够在基因组中引入突变,因而在基因治疗和基因功能研究方面具有巨大的应用前景.目前,国际上关于短片段同源替换技术的研究处于实验阶段.本文中,我们利用短片段同源替换技术在中国仓鼠卵巢(ChineseHamsterOvary,CHQ细胞中对特异性修复染色体外游离基因的可能性进行了探索性的研究.我们利用绿色荧光蛋白报告基因作为检测系统,可以在荧光显微镜下灵敏地

3、观察到经特异性修复后具有绿色荧光的细胞,并可以进一步通过FACS(FluorescenceActivatedCellSorter)定量检测基因转变的效率.实验结果说明：在利用最适浓度的阳离子脂质体Lipofectamine?2000(LF2000)转染的条件下,我们将载体上绿色荧光蛋白基因(EnhancedGreenfluorescentProteingene,EGFP的第58位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TAG,能成功地终止绿色荧光蛋白的表达.分别将带有第58位色氨酸密码子(TGG)的DNAt段FG1(393bp)和FG2(695bp)与上述含有缺陷型EGFPS因的载体用最适浓度

4、的LF2000共转染CHOffl胞后,用荧光显微镜皆能灵敏地检测到回复绿色荧光的细胞.进一步用FAC的析,确定了FG1和FG2介导基因转变的细胞的比例,证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因EGFP关键词短片段同源替换,位点特异性基因修复,同源重组,基因打靶1.引言传统的基因治疗其实是一种基因扩增(GeneAugmentation机制,即通过载体系统将正常基因导入,使正常蛋白在转染的细胞里表达,从而到达治疗的目的.这种方法的缺点是(1)为了使转入的正常基因长期有效表达,需要将外源的基因整合进入宿主细胞基因组,但是传统的方法可能导致发生较高频率的非同源重组,随机插入的DNA

5、片段可能引起细胞基因组的功能紊乱；(2)如果采用非病毒载体,载体的大小限制了那些保证转基因适量表达的重要调节因子的载入,cDNA的大小受限制,构建载体比拟困难,而且转化较大的载体不容易进入细胞内；(3)假设采用病毒载体,转基因所引入的病毒成分可能引起免疫反响,从而造成转基因失败；(4)这种传统的基因治疗方法只能用于治疗隐形突变所造成的基因病；(5)成功率比拟低,等等.这些限制使得人们寻找新的方法,而最新的方法是用基因打靶(GeneTargeting)的方法对突变位点进行直接的基因修复(GeneCorrection)0短片段同源替换(SmallFragmentHomologousReplacem

6、ent,SFHR是一种改良的基因打靶策略同,它源于同源重组,是将与靶基因序列同源的400-800nt的单链DNA(single-strandDNA,ssDNA)或者双链DNA(double-strandDNA,dsDNA)导入细胞,该DNAt段中含有特定的错配碱基、一个或几个碱基的缺失或者插入,用来更正基因组序列中的原一个或者多个核甘酸突变.如下列图所示：图1、SFH敬术修复基因可能的机理ntconversion,insertion,ordeletionFP1 .以靶基序列为模板、对其两端分别设计上游引物(forwardprimer,FP)和下游弓I物(reverseprimer,RP),通过

7、PCR扩增得到400-800bp的同源dsDNA短片段；然后通过热变性得到相应的ssDNA,转染入细胞.2 .ssDNA进入细胞核,同细胞基因组作用,形成D-loop结构,并且与之发生重组和交换；3 .内源性的基因修复使得基因组DNA序列更正为与ssDNA相同.而SFHR乍为一种利用基因打靶进行基因治疗的策略,它具有一系列优于上述传统的基因扩增的特点(1)进入的短片段DNA分子在体内进行直接的基因更正可以使基因保持在它原本的调控因子的限制下,不会影响细胞基因组的正常功能；(2)小分子的更正分子相对于质粒运载系统来说,可能增加向细胞以及细胞核转运的成功几率；(3)基因治疗一般用的是合成的小分子,

8、不会引起免疫反响(KriegAM等,2001);(4)它不仅仅可以治疗隐形突变引起的基因病,还可以治疗显性突变引起的基因病；(5)基因替换具有比拟高的效率(达1-10%),而表型的维持并不需要100%勺更正,因而有效和永久性的基因修复可以用更少甚至一次治疗就到达目的.SFHR的具体机理尚不清楚,但是它是源于同源重组开展起来的一项技术,似乎与同源重组有着相似的途径,例如应该都包括必要的基因校正,重组酶系统都引起媒介结构的生成,以及随后的单链插入和核甘酸的交换.但是具体的机理还有待澄清.同源重组(HomologousRecombination)是指序列相似的DNA间交换遗传信息的过程.该技术已经被

9、用于产生多种品系的转基因小鼠,提供了大量的遗传代谢疾病的模型(M?llerU,1999).然而,在体外实验利用同源重组修正遗传突变,效率非常低,仅10-5左右,并且通常伴有相等或者更多几率额外突变事件和非同源事件.短片段同源替换技术能够在哺乳动物细胞中产生位点特异的基因转变,效率到达0.120%.并且短片段同源替换技术不仅仅局限于改变靶基因的单个碱基,它能够同时改变多个碱基以及同时在靶基因的多处位点产生基因转变.同时,它不但可以用于修正缺陷型基因,还可以在基因组引进突变,从而为基因功能的研究提供一个有力的工具.目前,国际上对SFHRft术的研究尚处于实验阶段,但是已经取得一些成功的研究成果.例

10、如：在人的上皮毛孔细胞(HumanEpithelialAirwayCells)里,用SFHR对囊月中性纤维化跨膜传导调节蛋白基因(CysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulatorGene,CFTR)缺失三个碱基的突变型FA508进行基因更正,效率可到达1%67,而且可以在表型上表现出来；另外,以小鼠杜氏肌肉营养不良型基因(DuchenneMuscularDystrophy)的点突变为靶位点,培养细胞用SFHFE正,经PCR分析,效率高达15-20%I367'".但是,目前国际上只有少数实验室从事短片段同源替换技术的研究,并且研究对

11、象仅仅局限于囊月中性纤维化和杜氏肌营养不良遗传疾病的细胞系和动物模型.我们试图利用绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProteinGenEGFP)作为报告基因11012141在CHO细胞中进行短片段同源替换技术的初步研究,为在更加广泛的哺乳动物细胞以及小鼠胚胎干细胞中进行短片段同源替换技术研究奠定工作根底,并为研究基因功能和基因治疗提供新途径.我们采用靶向修复游离的缺陷型EGFP的策略,可以灵敏地检测到EGFP基因修复的绿色克隆.首先,我们采用两步PCR的方法在EGFP基因中引入点突变,使绿色荧光蛋白的第58位色氨酸(W58,TGG)突变为琥珀型终止密码子(TAG)

12、【11,131516】,构建载体pEGFP(-)-C1.然后以pEGFP-C1为模板,通过高保真PCR分别扩增含有EGFP第58位色氨酸(W58,TGG)的双链DNA片段FG1(393bp)和FG2(695bp),同时；以pEGFP(-)-C1为模板,使用同样的引物通过高保真PCR分别扩增对照片段FA1(393bp)和FA2(695bp).在24-well细胞培养板中使用阳离子月旨质体Lipofectamine?2000(LF2000)分别将质粒pEGFP(-)-C1和DNA片段FG1、FG2、FA1或者FA2根据质量比1:5瞬时共转染CHO细胞.转染后用荧光显微镜观察,FG1、FG2与pEG

13、FP(-)-C1共转染的细胞都有局部回复绿色荧光,说明FG1和FG2使CHO细胞中绿色荧光蛋白恢复了表达.进一步用FACS(FluorescenceActivatedCellSorterI16,171分析确定了FG1和FG2介导基因转变效率,证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因.2 .pEGFP(-)-C1载体的构建我们以质粒pEGFP-C1(Clontech)为模板,采用两步PCR定点突变方法,将EGFP基因编码序列中第58号色氨酸残基(W58)的密码子TGG突变为终止密码TAG(*),构建载体pEGFP(-)-C1.首先,用弓I物1U(5'-CACGGGGA

14、TTTCCAAGTC-3')和弓I物6D(5'-ACGAGGGTGGGCTAGGGCACGGGCA-3'),PCR扩增出384bp的上游片段P1;用弓I物6U(5'-TGCCCGTGCCCTAGCCCACCCTCGT-3')和9D(5'-CCTCTACAAATGTGGTATGGC-3')PCR扩增出672bp的下游片段P2,P1和P2中都含有引入的点突变(TGG-TAG).用0.8%琼脂糖凝胶电泳别离P1和P2,并切胶回收纯化(Wizard?PCRPrepsDNAPurificationSystem,Promega).取P1和P2大约各1

15、0ng,混匀后作为,g板,用引物1U和9D扩增出1031bp的包含有W58无义突变突变的EGFP-基因片段P3,P3的两端分别含有限制酶切位点NheI和HindIII.上述PCR反响皆使用高保真PfuDNA聚合酶进行.然后,取10gpEGFP-C1和5g片段P3分别进行NheI和HindIII双酶切.0.8%琼脂糖凝胶电泳别离pEGFP-C1和片段P3的酶切产物,分别回收3970bp的pEGFP-C1酶切片段和761bp的P3酶切片段.调节两者比例约为1:3,用DNALigationSolutionI(DNALigationKitVer.2,TaKaRa)进行连接反响,获得载体pEGFP(-)

16、-C1.CCCTGGCCCMCSSV40polyApEGFP-C1pUCori4.7kbf1oriHSVTKpolyASV40oriPSV4PCMVIEKanr/Ne0rP57W58P59EGFPHSVTKpolyACCCTAGCCCSV40polyApEGFP(-)-C1pUCori4.7kbf1oriSV40oriPSV4Kanr/Ne0rMCS|P57*58P59EGFP(-)图2、载体pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1.3 .pEGFP(-)-C1载体的鉴定我们用LF2000(4闻/each24-well)将纯化后的pEGFP(-)-C1(2闻/each24-well)转染CHO

17、细胞.转染48小时后,荧光显微镜下没有观察到绿色荧光细胞(见彩版：彩图1),说明了EGFP基因中的W58无义突变(W58一*58,TGG-TAG)能够有效地终止EGFP的表达.4 .DNA短片段的制备分别以pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1为模板,使用引物1U和2D(5'-AGGGTGGTCACGAGGGTGGGCC-3'),进行高保真(PfuDNA聚合酶)PCR反响,扩增双链DNA片段FG1及其对照片段FAKFG1和FA1均为393bp,处于EGFP基因的编码序列中.除第58位氨基酸残基密码子的中央碱基(FG1:TGG,FA1:TAG)外,FG1和FA1的其余序列均相同

18、.为了预防转染时模板的干扰,用0.8%琼脂糖凝胶电泳别离并切胶纯化FG1和FA1(见图3),再分别以纯化后的FG1和FA1为模板,使用引物1U和2D,进行高保真PCR反响,大量制备FG1和FA1,并用Wizard?PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promegsj)纯化,最终溶于无菌超纯水中.同理,分别以pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1为模板,使用引物1U和1D(5'-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3'),进行高保真PCR反响,以同样的方式可制备双链DNA片段FG2及其对照片段FA2,纯化(见图3)后最终亦溶于无菌超纯水中.FG2和

19、FA2均为695bp,处于EGFP基因的编码序列中,除第58位氨基酸残基密码子的中央碱基(FG1:TGG,FA1:TAG)外,FG2和FA2的其余序列均相同.图3、别离PCR反响所得DN即片段的电泳图Lane1:FA1Lane2：FA2Lane3:MarkerDL2000Lane4：FG2Lane5:FG1Lane6:pEGFP(-)-C15 .DNA短片段的鉴定我们利用LF2000(4闻/each24-well)分别将纯化后的FG1、FA1、FG2、和FA2(2g/each24-well)转染CHO细胞.转染48小时后,荧光显微镜观察,结果说明：单独转染DNA片段FG1、FA1、FG2和FA

20、2的CHO细胞均无绿色灾尢.6 .靶向修复CHOffl胞中游离的缺陷型EGPFS因6.1 共转染含有缺陷型EGPFS因的质粒及DNAW片段我们根据表1,设计4个转染组合,各自使用24-well细胞培养板进行转染.转染后24小时,将每个孔中的细胞对应传至单个35-mm细胞培养皿中,相当于1: 5传代.表1、不同的小片段DNA与pEGFP(-)-C1组合共转染CH6田胞加样表组合12345共转染的小片段DNA(3闻/each24-well)FG1FA1FG2FA2空白对照共转染的质粒DNA(0.6g/each24-well)pEGFP(-)-C1阳离子脂质体(4闻/each24-well)Lipo

21、fectamine?2000(LF2000)6.2 荧光显微镜检测根据表1加样转染后48小时用荧光显微镜观察,我们在组合1和组合3中发现绿色荧光的CHO细胞,而在对照实验组合2、组合4和组合5中的细胞均无绿色荧光(见彩版I:图2图6).6.3 FAC朋析转染结果我们依然根据表1中的转染组合使用24-well细胞培养板进行转染,每个组合平行做三组实验.转染后48小时将三组细胞用于FACS,分析50000个CHO细胞,计算绿色荧光细胞的百分比例,结果如图7所示.FACS分析说明：组合1中约0.08%的细胞具有绿色荧光,组合3中约0.15%的细胞具有绿色荧光,组合2、组合4和组合5中的细胞均无绿色荧

22、光.图7、各组合转染CHO细胞的FACS分析结果(平行三组实验)百胞细C的光荧色绿具比分0.20%0.15%0.10%0.05%0.00%组合1组合2组合3转染组合7.讨论短片段同源替换技术是近年来在同源重组的根底上开展起来的基因打靶技术.与传统的基于同源重组的基因打靶技术相比,短片段同源替换技术能够将打靶效率提升100010000B.目前,只有少数实验室从事短片段同源替换技术的研究,并且研究对象仅仅局限于囊月中性纤维化和杜氏肌营养不良遗传疾病的细胞系和动物模型.我们试图将短片段同源替换技术应用于更加广泛的哺乳动物细胞系以及小鼠胚胎干细胞系.作为初步研究工作,选择打靶CHO细胞中游离的缺陷型E

23、GFP基因的策略,使得极少数的CHO细胞在恢复绿色荧光表型后能够很容易在荧光显微镜下被观察到.由于这一策略的灵敏性,我们分别得到了0.08%和0.15%的经FG1和FG2小片段修复的细胞.为了确认我们所引进的EGFP基因无义点突变(TAG)能够终止正常绿色荧光蛋白的表达,我们用携带缺陷型EGFP基因的质粒pEGFP(-)-C1瞬时转染CHO细胞,荧光显微镜观察没有发现绿色细胞.这就说明无义突变的引入成功地终止了绿色荧光蛋白的表达,因此实验中pEGFP(-)-C1分别和DNA片段FG1、FG2共转染CHO细胞后,荧光显微镜观察到的绿色细胞并非pEGFP(-)-C1渗漏表达的结果,而是DNA短片段

24、同源替换引起的基因修正.起初短片段同源替换的研究通常使用变性后的PCR产物,即ssDNA片段,后来的研究说明dsDNA片段具有ssDNA片段同样的效果,本文中我们使用的是dsDNA片段.在制备短片段DNAFG1、FG2以及对照片断FA1和FA2的时候,我们为了预防PCR产物中存在的微量模板DNA可能对转染实验带来干扰,所用的片段均经电泳别离纯化后,再次PCRT增和别离纯化(见正文“4.DNAJ、片段的制备局部).将上述片段分别瞬时转染CHO细胞后均没有发现绿色荧光蛋白的表达,说明上述片段均不能单独引起绿色荧光蛋白的表达.另外,在根据表1的4个组合共转染CHO细胞后,我们仅在共转染FG1/pEG

25、FP(-)-C1和FG2/pEGFP(-)-C1的细胞中发现有绿色荧光蛋白表达.而本实验室有人曾经将pEGFP(-)-C1与红色荧光蛋白(DsRed1)基因的DNA短片断共转染CHO细胞,没有观察到任何细胞恢复绿色荧光.这说明短片段同源替换介导的基因修复具有序列特异性.FACS分析说明FG1和FG2修复缺陷型EGFP的细胞比例分别为0.08%和0.15%.由于并非所有的细胞都同时转入了片段和质粒,我们必须校正转染效率才能够换算出基因修复效率.我们共转染等量的pEGFP-C1和片段FR,估计质粒的转染效率约为1020%.校正后的*$染效率约为0.1%1%,此结果与国际上其他研究组获得的结果相当.

26、短片段DNA的稳定性是本实验成功的关键之一.由于DNA片段没有进行任何修饰,进入细胞中的短片段DNA可能会被细胞中核酸酶降解而不能起到修复基因的作用.但是,参考本实验室其他研究人员的工作成果,在CHO细胞中单独转染短片段DNA72小时后,仍然可以检测出完整存在的短片段；说明进入CHO细胞中的短片段DNA,降解较慢.我们考虑到脂质体的包裹可能对短片段的稳定性起到一定的作用,采用了脂质体转染的方法,而不是本实验室常用的磷酸钙共沉淀法或者电穿孔法.另外,短片段DNA之间稳定性的差异,可能是导致两种不同长度的DNA片段FG俐FG2打靶效率不同的原因.人们对于短片段同源替换技术潜在的担忧就是,进入细胞中

27、的短片段DNA可能会随机整合进入细胞基因组DNA中.但是,从本实验室其他研究人员采取PCR检测的结果说明,DNA短片段没有随机整合入细胞基因组DNA中.我们在CHO细胞中的初步研究结果说明,短片段同源替换技术在基因治疗和基因功能研究方面具有广阔的前景.本实验只研究了利用短片段同源替换技术对EGFP基因中的单碱基突变进行修正,今后我们将致力于在不同细胞中研究短片段同源替换技术对于多个碱基和同一靶基因中多个位点的修复水平.对利用短片段同源替换技术进行基因打靶而言,建立适宜而有效的筛选机制以及提升打靶效率是该技术今后开展的关键问题.致谢我要感谢李政道先生及其家人设立的“政基金,为我们提供了一次在本科

28、生接段参加科学研究的时机.同时我还要深深感谢我的指导老师薛友纺教授,感谢她一年多来对我的学习上的鼓励,工作上的悉心指导,生活上无微不至的关心和理解,以及在本论文修改正程中付出的极大心血.感谢李成建师兄在这一年多时间里给予我的热情无私的帮助和指导.李师兄对于科学研究的热爱,以及对工作的一丝不苟、严谨务实,都给我竖立了良好的典范.感谢汤富酬、杨红波、赵文宁、时燕、张俊争以及宋臻涛在平时的学习、工作以及生活上给予我的照顾.感谢最亲爱的父母对我暑假研习工作的支持.整个假期我都没有回家看望二老,他们不但没有责备我,相反,经常地给以我鼓励和鞭策.谨向所有关心和支持我的老师、家人和同学表示最诚挚的感谢！参考

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