湖底沉积物有机磷的释放

1、 湖底沉积物中有机磷的释放1、 引言P作为一种营养物质在水环境中的重要性很好去理解，近些年，有机磷化合物作为有活性的磷的一种形态，其重要性也引起了人们的关注。有机磷化合物，易被视为是难降解的磷的一部分，而现在已知的其所含有的许多不稳定的种类可能在水体磷的循环中起着重要的作用。在多数水环境中，沉积物在磷循环中起着重要的作用，因为它可以储存了一大部分从水体沉淀下来的P，无论是暂时的还是长久的。暂时储存的P最终会被水体吸收。在一些磷输入量大且易于沉淀的地方，底泥的磷循环可能会大于河流表体。最近一些研究表明，有机磷化合物在水体富营养化中有着很大贡献，因此，研究控制底泥磷释放的因素显得尤为重要。一些关于

2、无机磷化合物的研究已被提出，然而关于特定的有机磷化合物的成岩作用及潜在的迁移性方面的研究却很缺乏。因此研究影响底泥有机磷迁移运动的因素是非常必要的。然而，这些机制在自然条件下很难监测，一些具体数据通过实验室的控制实验来获取。实验室研究了不同条件下底泥磷的释放，可以得知磷的潜在的迁移量，但是无法辨别是哪种形态的P释放。磷核磁共振波谱（31P NMR）技术可以区分不同种类的有机磷化合物，因此被用来检测哪种形式的磷在试验中从底泥中消失或减少了。通过操纵P释放实验，我们可以知道对在不同条件下哪种有机磷可以短期或长期存储在底泥里。利用31P NMR技术，我们可以识别不同磷化合物在不同氧水平下的迁移性，因

3、为氧化还原条件是底泥P迁移运动的主要驱动力，包括内部负荷。另外，我们也对微生物种群进行了调查，因为就像氧化还原条件一样，微生物活动也很可能很大程度上影响P的运动转化。这些过程确实是紧密联系在一起的，例如细菌在还原条件下P的释放，这个过程在缺氧条件下可能会引起很大部分P释放出来。此外，细菌通过其所含电子受体接受电子来利用和分解有机质的事实，这说明氧化还原作用起到关键作用，也反映了微生物的活性。温度是影响底泥生物过程的另一个重要参数，底泥负荷随季节性而变化就可以证明此观点，这可能是由于随着温度的升高，有机质在微生物作用下发生了矿化现象。温度的升高，除了会影响底泥中有机磷的矿化，同时也会增强无机磷的

4、释放。我们进行了在不同场景下的模拟实验，将底泥设置为不同的氧气水平、不同温度以及在加入葡萄糖（高活性）或福尔马林（低活性）下不同微生物活性。这些添加物用来调查微生物种群的影响，尤其是能否区分不同种类的磷是发生了生物降解还是化学降解，因为添加的葡萄糖可以为底泥中微生物提供生长基质，促进磷的生物降解。这样一方面会使得矿化作用和磷的释放增加，另一方面会增强P的吸收。如果微生物种群有限，那么将会有较少的P释放。相反地，在沉积物中添加甲醛是用来终止微生物的活性的，使得化学分解成为主要过程。添加葡萄糖和甲醛同时分别在高和低的氧气水平下都进行了实验，以此来研究氧化还原电位对微生物种群的潜在影响。2、 材料与

5、方法 2.1 样品和实验地点这项研究中，底泥沉积物来自中度富营养化的Erken湖，在实验室条件下，用于后续潜在的程岩变化。该湖面积24平方公里，平均水深和最大深度分别是9m和21m，其水体的TP平均浓度是27ug/L。其流域面积137Km2 ,大部分是深林和营养丰富后冰河泥土层。在夏季分层，湖底水体偶尔会变为缺氧状态。该湖泊已被广泛研究， Rydin认为该湖已进入一个稳定的营养状态。使用重锤取样器（Willner取样器）在16m水深的50区域里取了12个沉积物样品。把0-1cm的泥层收集、合并，使其均质化后获得足够大的代表性样品用于实验。此样品中干重泥样的TP浓度为2.0mg/g、含

6、水量93%、有机质含量为200mg/g以及Fe含量为24mg/g。此外，湖底水体pH在7-7.5范围内变化。 2.2 实验室装置上述获得的沉积物样品划分出20个各15g的子样本，分别装进沉积室（如图1）并注入水。不同特征的水被泵以0.3L/d的速率从下方穿过沉积物注入到沉积室里，设置流速缓慢并且使得流量对沉积物的物理影响作用最小，即没有松动或压实作用。将沉积物样品在不同条件下处理，即好氧/缺氧条件、不同温度条件（4/20）以及加入葡萄糖（1%）/甲醛溶液（3.7%）下的好氧/缺氧条件（20）。温度的选择是模拟湖底沉积物表面最高和最低的环境条件。溶氧条件主要通过氧化还原电位的测量，并使用还原剂（

7、亚硫酸盐）来校正。好氧条件被认为是进水与周围空气达到平衡，缺氧则是氧化还原电位低于0mv时。在整个试验过程中，要确保正确且一致的氧浓度、pH值以及添加剂的浓度，所有方案中pH值均为7。每个样品处理均设为三个平行样，除了添加葡萄糖和甲醛溶液外，因为空白控制是重复的。每天一次采集各个子样本的污水进行磷酸盐和TP的分析，计算试验过程中磷的释放。TP（用1mol HCl于120消解1h）和磷酸盐含量根据Murphy-Riley法进行分析。试验进行21天，将沉积物从沉积室腔室中取出提取并进行核磁共振分析。 Fig. 1. Schematic picture of the sediment chamber

8、. 沉积室示意图 2.3 碱法提取用31P NMR技术分析的所有样品都要经过预提取，用0.067mol的EDTA（二钠盐）处理1h，目的是为了提高提取率。预提取后，经沉淀分离EDTA溶液后在4000 rpm（转）离心10分钟，剩余的沉淀物在室温下用0.1mol的NaOH经16h后提取，NaOH提取液经离心分离。所有的提取物与溶剂配成1:3。在35下经旋转蒸发把样品浓缩10倍。浓缩的提取物进行冷冻保存直到进行分析，经验证明这样不会影响到提取的磷化合物。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定提取物中的TP。 2.4 核磁共振分析31P NMR技术是使用Varian me

9、rcuryplus核磁共振光谱测定仪在121.5MHz条件下进行测定。测量前向提取物中加入足够量的 D2O使得其测定时可获得稳定的信号。光谱记录使用63个观察脉冲，获取时间为0.4s，1.2s的延迟时间，获取3000左右的瞬变值（12h）。化学变化可间接地参考外部85%的H2PO4(=0.0)的稳定信号。沉积物提取物中加入标准液（Na2HPO4.7H2O正磷酸盐和Na2P2O7.10H2O焦磷酸盐）后测定其光谱观察吸收峰的分布，并与文献比较（Hupfer etal., 1995, Cade-Menun and Preston, 1996,Makarov etal., 200

10、2 and Turner etal., 2003)。为了获得峰的面积，原始峰谱信噪比超过4，具有洛伦兹形状，采用NMR软件子程序 (Vnmr 6.1C)。从这些峰的地区，个别磷化合物的贡献计算其相对的P的总提取量。EDTA的预提取不适合做31P NMR技术分析，因为P浓度太低以及高浓度的顺磁金属如Fe、Mn会产生干扰。而我们认为经EDTA提取后结合金属Fe、Al的主要是无机磷。3、 结果经不同处理的沉积物样品间，其磷酸盐和总磷的累积释放表现出相似的趋势，磷酸盐的释放约为TP的50%。例外的是4处理时的沉积物其P释放相对较少，释放的都是磷酸盐。表1，平均值包括标准差

11、都是基于复制或三份分析，确定的磷化合物组，百分率用斜体表示，以及TP和磷酸盐的积累释放。Table.1 图a.b所示，随试验装置的运行所测得污水中P的总积累释放量。用20和4分别表示20、4。当没有出现数字时，温度为20。Ox和Anox分别被用来表示氧水平好氧状态和缺氧状态；用glu和form来表示添加葡萄糖或者甲醛溶液。从图中可以看出，大多数沉积物样品的P释放在试验终止时也会停止释放(图2a和b)。有三种缺氧处理的样品例外（分别是甲醛、葡萄糖、20的条件），它们在试验终止时仍然会继续有P的释放。这三种处理方法也表现出最高的沉积P的释放，葡萄糖处理下对应的P的释放率超过了75%。相比之下，经2

12、0的好氧处理的子样品其P释放率只有10%而已。在不同的处理方法下，累积TP的释放范围是10-1600ug/g，而累积磷酸盐释放范围是20-700ug/g(图2b)。总磷和磷酸盐释放的相对标准偏差一般在1030%。原始沉积物干重样品中可提取0.9mg/g的P，可被分为7组：正磷酸盐 (Ortho-P)、磷酸单酯 (Mono-P)、三组不同的磷酸二酯、DNA-P、磷脂质(P-lipids)（可能的磷壁（酸）质（Teichoic-P），但这也有可能是另外一种磷脂的结果）、焦磷酸盐 (Pyro-P) 、多磷酸盐 (Poly-P)。在一些光谱中Pyro-

13、P峰附近会出现额外的峰可能表明Poly-P末端基团的存在。Fig. 3. Typical solution 31P NMR spectra from the various set ups, including the original.在曝光后，在大多数子样本中均能发现这7组P的成分。添加葡萄糖的缺氧子样本是个例外，发现其Pyro-P消失了。经甲醛处理过的样品中，好氧子样品缺少了Teichioc-P, 磷脂质（P lipids）和DNA-P；而缺氧子样品缺少磷脂质（P lipids）, DNA-P and 聚磷酸-P（Poly-P）（表1，图3）。含糖的缺氧子样品和含甲醛的好氧子样品，在曝光

14、后，干重中只有500ugP/g。这与两个好氧子样品形成了对照，在没有添加物下，该两个样本几乎没有释放磷，初始0.9mg/g的干重P浓度依然被存在。经不同处理后的子样本中磷化合物的组成由很大差异（表1，图3）。一般来说，正磷酸盐 (Ortho-P)和磷酸单酯 (Mono-P)的浓度最高，并且大多数样品中前者高于后者。与此不同的是，葡萄糖子样品和20缺氧处理的子样品中磷酸单酯 (Mono-P)的浓度最高。在不普遍的磷化合物中，聚磷酸-P（Poly-P）在没有添加物的好氧处理中占优势， 在其它大多数组中 DNA-P 浓度常常是第三高的。与原

15、始样相比，聚磷酸-P（Poly-P）浓度一般都会下降，只有4时的好氧处理的聚磷酸-P（Poly-P）浓度保持不变；另外，正磷酸盐 (Ortho-P)和磷酸单酯 (Mono-P)的浓度是普遍增高的。关于样品中小成分，与原始样最大的不同是添加甲醛后的Pyro-P的变化。另一方面，Teichoic-P仅仅发生微小的变化（表1，图3），除了添加甲醛的好氧处理中该物质的消失。除了添加甲醛的好氧处理的标准偏差较高外，一般情况下，大多数子样本中不同的磷化合物变化的标准偏差均在10-15%范围内（表1）。采用GLM（广义线性模型）在Minitab中对影响结果的因素进行了方差分析(Minit

16、ab inc., State College, PA, USA)。这些研究表明，在所有情况下，除了正磷酸盐 (Ortho-P)和磷酸单酯 (Mono-P)外，使用添加剂设置的不同的治疗方法所确定的磷化合物组之间关于氧化水平有明显的差异。相比之下，只有聚磷酸-P对温度的选择可表现出明显的差异（表2）。需要注意的是虽然用添加剂作单因素方差分析，但是研究的这两种添加剂却对沉积物中有机磷化合物组的构成有着很大影响。表2： 对所确定的化合物根据其对不同实验设置变量（温度、氧水平、添加物）的依存关系进行方差分析。星星（1、2或3）表示5%、1%和0.1%的显著性水平（p值为0.05、0

17、.01、0.001）。结果如下： 为了便于解释表2中的个别磷化合物组，采用7.6版本的主成分分析（PCA）来进行。PCA使用个别化合物自动定标数据，PC1、PC2分别描述38%和29%的变化（图4）.为了阐明影响因素对主成分的影响，对个别磷化合物的评分值进行方差分析。根据结果，PC1表述了添加剂（p < 0.001）的影响，PC2主要表述氧水平(p < 0.001)的影响，同时一定程度上也表述了添加剂 (p = 0.006)的影响。在图4a中沿着PC1，可以发现添加剂分组的情况，往装置中添加甲醛的在左边，添加葡萄

18、糖的在右边，没有添加物的在中间。相应的差异可以载荷图（图4b）中看出，添加甲醛能诱导高浓度的正磷酸盐 (Ortho-P)和磷酸单酯 (Mono-P)但低浓度的 Lipid-P（磷脂质）, DNA-P 和 Mono-P（磷酸单酯）。虽然氧气条件对PC2的评分值有很大影响，但由于添加剂的并发影响使得在评分图（图4）中没有明显的分组现象。Fig. 4.  从沉积物中提取的有机磷组分经不同处理后的主成分分析。图4a显示的是PC1和PC2的评分图，坐标轴表示方差（%），而图4b表示的是对应的图4a的负荷。评分图表示不同处理方式之间的差异性，而负荷图表示的

19、是对有机磷化物的依存性。4、 讨论 4.1 总体来说释放这项研究表明，特定的有机磷化合物可以反映微生物种群。如当微生物量降低时，磷酸二酯（DNA-P、磷脂质和磷壁酸）都消失了，这表明这些磷化合物的微生物来源。从与原始样本比较中，就个别的磷化合物组来说，可以看出在各种处理中P的减少主要来自聚磷酸P，先前的研究也可以证实聚磷酸P很容易从沉积物中释放。这说明在任何的研究条件下沉积物都不会有聚磷酸P的净产生量。同时，转而说明沉积物中Poly-P的发现在很大程度上会在水体中残留，正如对Erken湖的早期研究，也支撑了Hupfer等人对欧洲22个湖泊的研究结论。应该指出的是，处理时的环境参数和在4的好氧处

20、理最相似。这种处理因此在许多方面被认为可作为一个控制处理，关于试验中有机磷组分的释放和构成的结论也可能被与原始沉积物样本和4好氧处理比较。 4.2 氧气水平相比好氧处理，试验发现了在缺氧条件下的一个重要结果。缺氧处理会诱发更多的磷释放，尤其是在添加葡萄糖情况下。我们的研究结果表明 Mortimer（1941）的假设：缺氧条件下内部P的释放是源自于Fe-P化合物的溶解，这易与因矿化作用的磷释放混淆。一部分磷酸盐可能源自聚磷酸-P的矿化，通过分析得到在一些处理中聚磷酸P浓度显著降低，释放的磷被证明其组成了磷酸盐。然而应该注意的是，在用钼酸盐分析时，有一部分磷是可能是由于水解产生的。与好氧

21、处理相比，低浓度的活性聚磷酸P和磷脂质在缺氧处理时的表现反映了沉积物在自然缺氧条件下的P的显著释放能力。缺氧条件下，由聚磷酸P和磷脂质产生的大量的中间产物如Pyro-P and Mono-P，这很可能表明缺氧条件下降解的程度更高。实验室特意选择适当的缺氧条件，是为了确定所有出现的自然条件被覆盖其中，如夏季可能出现的停滞期（淤塞）。这可能意味着对有机磷化合物的影响比在湖中时的略大，但是其降解和释放的原则是一样的。4.3 温度在低温处理时，磷酸盐和总磷都表现出最低的释放量，这说明这种情境下微生物的活性被限制。这种情况下，虽然核磁共振的结果表明4时微生物的活性很低，但是在 Poly-P&#

22、160;和 Pyro-P之间存在着转化。除此之外，Pyro-P 似乎也表现出独立增加性，这就更难以解释了。比较在4下和20下的处理，可以发现在初始阶段温度越高，就有更多的Poly-P 被去除。这可能是由于较高的矿化率所致，与内部负荷随季节变化的特点一致，就像 Jensen and Andersen (1992)曾报道的那样。然而，温度对P释放的影响并没有氧水平对其的影响大，虽然较高温度下有稍快的释放（图2，a和b） 4.3 福尔马林（甲醛溶液）在添加甲醛的缺氧处理中，磷酸盐只占总释放量的20%，这表明沉积物中大量的磷损失了（可能是来自有机磷形式）。这与事

23、实相符，即甲醛杀死微生物导致沉积物中这些形式的P的释放。因此，在这种处理下，包括无机磷如铁结合态P在内，还有微生物P都释放到水体中，如磷酸盐和生物酶P。然而在所有含添加物的处理都显示出Poly-P大量减少，只有在那些添加甲醛的处理中显出出DNAP和磷脂质的缺少。除此之外，在添加甲醛的好氧处理中也表现出除Pyro-P外所测量的所有磷形式都呈下降趋势，这很有可能反映出Poly-P物在分解过程中的一个中间步骤。这说明了大多数的Poly-P都与微生物量有关，但是就像所有的处理不会有Poly-P的净产生一样，这并不影响我们的假设即沉积物中的Poly-P主要来于水体。然而有机磷、Poly-P、Pyro-P的化学分解在某个确定的环境下是显著的，当然，这并不是说经添加甲醛处理后的所有的改变都是由于纯粹的化学过程所致。更可能的场景是，在这些处理中具有活性的Poly-P、DNA-P 和磷脂质的缺少恰恰反映出微生物量的减少，这是由于甲醛具有毒性，而各种细菌也经常含有这些种类的P。当这些细菌死后，它们在这种毒性环境中不会被降解和循环，取而代之的是它们将会随着水流而被从沉淀室中冲出来。在好氧条件下的磷酸单酯 (Mono-P)的减少，可能反应的是化学分解，因为这类化合物是难以进行快速微生物降解的，如肌醇六磷酸。 4.5 葡萄糖 在添加葡萄糖条件