miR-31转基因小鼠的构建及应用

1、miR-31 转基因小鼠的构建及应用第一部分 mi R-31 转基因小鼠的构建目的: 构建稳定过表达mi R-31 转基因小鼠 , 对阳性小鼠心脏、肝、脑、脊髓等组织器官mi R-31 表达进行检测 , 为研究mi R-31 过表达在体内的应用提供合格稳定的工具鼠。方法:mi R-31 转基因小鼠的构建及鉴定。利用 Gatewayclone 技术构建 mi R-31 过表达载体 , 把构建好的载体通过DNA显微注射技术移入受精卵内, 接着将受精卵移植入假孕小鼠体内, 随后等待母鼠自然生产。提取新出生小鼠尾部的DNA,利用 Fsat-PCR 和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定筛选过表达 mi R-31 的

2、转基因阳性小鼠 , 将遴选出的阳性鼠置于屏障环境中,标准饲养和交叉配种繁育, 随时观察并记录相关基本数据。提取阳性转基因小鼠的心脏、肝、脑、脊髓等组织器官的micro RNAs,利用RT-PCR检测 mi R-31 的表达量。结果 : 成功构建了 mi R-31 转基因小鼠 , 其在各个生长阶段的身体长度、 体重、毛发等基本生理体征与野生型FVB小鼠相比并没有差别。心脏、肝、脑、脊髓等mi R-31 的表达均增高且稳定。结论: 通过使用Gatewayclone 技术成功建立了mi R-31 过表达转基因小鼠 , 并且 mi R-31 的表达在各代小鼠中均增高且稳定, 为探究内在过表达mi R-

3、31 对机体的影响提供合格稳定的工具鼠。第二部分 mi R-31 转基因小鼠的应用目的 :1 、检测并对比 mi R-31 转基因小鼠和野生型 FVB小鼠脑室和脊髓中Nestin 的表达量和 NSCs数量 , 意在探讨内在过表达 mi R-31 对神经系统生理状态及疾病修复( 小鼠脊髓损伤模型 ) 的影响。2、对 mi R-31 转基因小鼠的应用进行扩展, 研究内在过表达的mi R-31 在免疫系统疾病 ( 小鼠银屑病模型 ) 中的调控作用。方法 :1 、提取 mi R-31 转基因小鼠和野生型FVB小鼠脑室和脊髓的Total RNA,利用 RT-PCR检测脑室和脊髓中Nestin 的表达量

4、, 利用免疫荧光方法检测脑室和脊髓中 NSCs数量。 2、利用咪喹莫特乳膏对mi R-31 转基因小鼠和野生型FVB小鼠进行银屑病模型制作, 对 mi R-31 下游靶基因进行预测筛选, 在银屑病模型刚出现症状时 ( 第 3 天) 和最严重时 ( 一般 5-8 天 , 默认为第 7 天) 检测皮损组织处miR-31 及筛选靶基因的表达 , 并对筛选靶基因进行western blot检测。另外 , 解剖后观察两组小鼠脾脏的变化状况。结果:1 、 RT-PCR检测结果表明 ,mi R-31 转基因小鼠脑室和脊髓中 Nestin 的表达量高于野生型 FVB小鼠 ; 免疫荧光结果表明 ,mi R-31

5、 转基因小鼠脑室和脊髓中 NSCs的数量也比野生型 FVB小鼠高。2、咪喹莫特乳膏诱发两个实验组小鼠均产生银屑病表型, 具体表现为涂抹区域出现红斑、 银白鳞屑 , 表皮增厚等 , 经造模图片对比发现mi R-31 实验组较野生型 FVB实验组银屑病样症状轻。RT-PCR结果显示 mi R-31 的表达在野生型FVB小鼠组中升高 , 在 mi R-31 转基因小鼠组中却降低, 靶基因 Sfn 、 Su Fu 的表达则是相反结果。western blot结果与 PCR结果一致。经解剖发现 , 两个实验组小鼠脾脏均出现淤血肿大现象, 但mi R-31转基因小鼠的脾脏淤血肿大程度较野生型FVB小鼠弱。结论 :1 、mi R-31转基因小鼠脑室和脊髓中的NSCs数量多于野生型FVB小鼠 , 为进一步探究内在过表达 mi R-31 对机体神经系统的影响及神经系统相关疾病 ( 小鼠脊髓损伤模型 ) 的修复提供便捷。 2、内在过表达 mi R-31 对免疫系统疾病的调控作用 , 在银屑病动物模型中 ,mi R-31 转基因小鼠由于其皮肤银屑病样症状较弱及脾脏淤血肿大症状较轻, 我们推测内在过表达mi R-31 因其调控作用而减弱银屑病严重