10呋喃妥因快速检测试剂盒说明书

1、2010-01版 呋喃妥因代谢物（AHD）快速检测试剂盒说明书一、 原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中的AHD，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的AHD和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的AHD含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃妥因代谢物含量。二、 试剂盒技术指标：试剂盒灵敏度： 0.05ppb样本检测下限：组织（鸡/鸭/猪/牛/羊/鱼/虾肉）-0.1ppb肝脏（鸡/鸭/猪/牛/羊肝脏 ）-0.1ppb蜂蜜、牛奶、肠衣-0.1p

2、pb鱼/虾等水产品组织因存在一定的干扰，检测下限为0.15ppb交叉反应率：呋喃妥因代谢物 100% 呋喃唑酮代谢物0.1%呋喃它酮代谢物0.1%呋喃西林代谢物0.1%回收率：组织、肝脏90%±15%蜂蜜、牛奶、肠衣80%±15%三、试剂盒组成1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb 3、 酶标记物 12ml 红色帽 4、 抗体工作液 7 ml蓝色帽5、 底物A液 7ml白色帽 6、 底物B液 7ml黑色帽 7、 终止液 7 ml 黄色帽8、 20X浓缩

3、洗涤液40 ml白色帽9、 2X浓缩复溶液 50 ml透明帽10、 衍生化试剂10ml 白色帽四、 所用仪器、试剂具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g） 微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道250µl试 剂：氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾（所有样本使用）亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）、ZnSO4·7H2O（奶样专用）五、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（

4、a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。样本前处理需配制：配液1用去离子水将2X浓缩复溶液按1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水），用于提取后的样本复溶配液2C液：（供奶样用）称12.5g 亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。D液：（供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。 配液3 0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O加去离子

5、水溶解定溶至1L。配液4: 1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。配液5： 1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。样本的处理方法：（a）奶样1、 取出5ml的样本到玻璃离心管中，分别加入C液和D液各250µl；2、 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min,4-12。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8，然后离心；3、 接(b)的描述方法（b）组织、蜂蜜、肠衣、肝脏1、 取1±0.05g的均质物（组织、蜂蜜、肠衣、肝脏），牛奶的离心上清液1.1ml（相当于1ml的奶样），分别加入4ml的蒸馏水,0.5ml

6、1M HCL和100µl衍生化试剂，充分振荡；2、 在37过夜孵育（大约16h）或56水浴中孵育(2h)；3、 分别加入5ml 0.1M K2HPO4 ，0.4ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振荡5min；4、 在室温下（20-25）4000r/min以上离心10min；5、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一个容器中于50氮气/空气吹干。6、 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀释好的复溶液充分混合30s；在室温下（20-25）4000r/min以上离心10min；7、 取50µl下层用于分析。样本稀释倍数：2六、酶标免疫分析程序1、 使用前将试剂盒置于室温（20

7、-25）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8不要冷冻。3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。4、 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔平行。5、 加标准品/样品50µl/孔到各自的微孔中，然后加入抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，37环境中反应30min。6、 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。加入250µl/孔洗涤液，1

8、5-30s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。7、 酶标记物：加入酶标记物100µl/孔，用盖板膜封板，37环境中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。8、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，37环境中避光显色15min。 9、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。七、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与AHD的含量成负相关。1、粗略判定：用样品

9、的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AHD浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.238，样品2的吸光度值为1.130，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.821；0.05ppb为1.484；0.15ppb为1.163； 0.45ppb为0.657； 1.35ppb为0.290； 4.05ppb为0.116。则样品1的浓度范围是1.35ppb-4.05ppb；样品2的浓度范围是0.15ppb-0.45ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。2、定量判定：所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即

10、百分吸光度值。百分吸光度值（%）B×100%B0B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B00ng/ml标准溶液的平均吸光度值以标准品百分吸光率为纵坐标，以AHD标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。八、注意事项1、 用前将所有试剂温度回升至室温20-25。2、 用之后立即将所有试剂放回2-8冰箱。3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EL

11、ISA测定程序中的要点。4、 所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。5、 试剂及标本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的OD值偏低。6、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。7、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。8、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。9、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。10、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11、 显色液若有任何颜