发酵工程电子版

1、精选优质文档-倾情为你奉上发酵工艺原理（发酵工程）讲 义王莘2012.8.20第一章 绪论发酵工业应用：生物生物学一、发酵定义：从工业微生物角度的发酵：利用培养微生物来获得产物的有氧或厌氧的任何过程，现在有扩大到培养生物细胞（含有动物、植物和微生物）获得产物的所有过程。从发酵工业角度的发酵：借助微生物在有氧和无氧条件下的生命活动来制备微生物体本身，或共同直接代谢产物或次级代谢产物的过程统称为发酵。传统发酵：酱油、醋、酒、长毛豆腐。新兴发酵：有机酸、酶制剂、抗生素。发酵工业的划分：食品工业（酿造工业）和非食品工业（发酵工业）发酵工业：利用生物的生命活动生产的酶对无机或有机原料进行酶加工获得产品的

2、工业。二、发酵工业具备的条件： 要有某种适宜的微生物。 要保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧浓度 ，酸碱度等）。 要有进行微生物发酵的设备。 要有将菌体或代谢产物提取出来精制成产品的方法和设备。三、发酵工业的改革1天然发酵阶段特点：1）家庭作坊式生产；2）容易感染细菌 ； 3）厌氧发酵；4）非纯种培养； 5）凭经验传授技术； 6）产品质量不稳定。2纯培养技术的建立阶段纯培养阶段特点：（1）多为好氧产品；（2）、均为表面培养；（3）、产品生产过程简单；（4）、设备要求不高；（5）、生产规模不大。3通气搅拌发酵技术的建立阶段第二次世界大战爆发，1929年英国人费莱明发现青霉

3、素，迅速形成工业大规摸生产。1940年英国人费洛里精制分离青霉素医治战伤药物。发酵工业新篇章：发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物。发酵工程产业化发展：发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题 。细胞大规模培养技术：细胞大规模培养 微生物、动植物细胞、藻类细胞等4代谢控制发酵技术5开拓发酵原料时期6基因工程阶段四、发酵工业的范围： 现代发酵工业涉及领域按微生物发酵产品的性质分为以下几个方面。1 微生

4、物菌体发酵2微生物酶发酵：3 微生物代谢产物发酵4微生物的生物转化发酵：生物转化与化学反应相比优点：反应条件温和，对环境无污染。5微生物特殊机制的利用（1）利用微生物消除环境污染环境恶化（2）利用微生物发酵保持生态平衡（3）微生物湿法冶金：（4）利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域五、发酵工业的特点1.发酵原料的选择2.微生物菌种得选育及扩大培养3.发酵设备选择以及工艺条件控制发酵工艺控制关键：发酵全过程的无菌状态的保持，防杂菌污染，设备冲洗，培养基灭菌，空气过滤。4. 发酵产物的分离提取5.发酵废物的回收和利用 第2章 发酵培养基第一节 培养基的类型及功能 培养基：是人们提供微生物生长繁殖和生

5、物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。（人工配制的含有营养物质的供微生物生长的介质。）发酵培养基作用：满足菌体生长+促进产物形成。一、培养基的营养成分及来源1、能源 2、碳源 3、氮源 4、有机盐 5、特殊生长因子 二、培养基的类型和用途1、按物质来源分：自然培养基（化学成分不清楚，异养微生物完全培养基）、合成培养基（化学成分和数量已知配制，实验室用生长慢）、半合成培养基（天然碳、氮、生长因子和化学药品，多数微生物使用）合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培养基叫合成培养基。复合培养基（天然+半合成）：由一些组成成分不完全明确的天然有机物与一些无机盐组合的培

6、养基。2、按物理性状态分：固体培养基、半固体培养基、体培养基固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 。半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。 3、按生产工艺用途分：从发酵生产应用考虑）孢子培养基、种子培养基、发酵培养基，工业中常用种子和发酵培养基用生产。（1）孢子培养基：供制备孢子用的。孢子：某一生长阶段中，在营养细胞内形成一个圆形，卵圆形或圆柱形的休眠体叫孢子。（2）种子培养

7、基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。（3）发酵培养基：是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。三、发酵培养基的选择： 培养基供菌生长、繁殖、代谢、合成产物的营养物质。培养基成分和配比的适合与否影响菌的生长代谢，对产物的工艺质量和产量影响大。1、选择和培植发酵培养基对应考虑的基本原则：（1）、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。（2）、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。（3）、有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。（4）、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。（5）、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。（6）、原料价格低

8、廉，质量稳定，取材容易。（7）、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。2、工业化发酵培养基选择步骤：（1）、了解菌种来源、生活习惯，理化特性和营养要求。（2）、了解生产菌种的培养条件、生物合成代谢途径、代谢产物化学性质、结构、工艺、产品质量要求。（3）、选化学合成培养基进行摇瓶试验每小发酵罐培养，氮、碳产物代谢能力情况的摸索，选择适宜的pH值。（4）、确定培养基配比确定金属（非）离子的影响无机要素营养要求，按高低、适中进行确定做复合培养基试验做发酵条件与培养基关系试验用碳酸钙调pH值中间补料法控

9、制碳、氮、养料、前体类物质代谢引导发酵向合成产物的途径发展。四、配制工业发酵培养基的一般要求：1、营养物组成较丰富，浓度适当，能满足菌丝体菌种发芽和生长繁殖成大量具有生理功能的需要（产物合成潜力提高）2、在一定条件下，各种原材料彼此不产生化学反应，理化性相对稳定。3、粘度适中，渗透压适当。4、原材料品种及浓度对代谢产物生物合成过程要有利于主产物的生物合成，高产率维持时间长，副产物合成率要降至最低。5、不影响发酵过程的通气和搅拌，便于产物的分离纯化。6、原材料尽量选质优价廉、成本低。 第二节 发酵培养基的成分及来源 培养基原料：C（50%）、N、无机盐、微量元素、水、生长因子、前体。一、碳源：（

10、微生物自身细胞物质、糖类、脂、蛋白质等和能源构成菌体的主要元素及各代谢产物的主要原料。）定义：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称碳源。功能：提供能量的重要元素。碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有机酸、醇、碳氢化合物（烃类）1、碳水化合物（糖类）（1）单糖：葡萄糖（实验室培养基）所有的微生物都能利用葡萄糖；但是会引起葡萄糖效应；工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标；糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是

11、许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。（2）双糖：乳糖、麦芽糖、蔗糖（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工业化过程常用淀粉水解物酶法水解为发酵糖。 （4）淀粉、糊精：使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应2、脂肪：霉菌和放线菌利用油脂作碳源，其具有消沫和补充碳源的双重作用。3、无机酸、醇：在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、抗生素发酵中作碳源和补充碳源。4、碳氢化合物（烷烃）：微生物表面糖脂吸收系统乳化后利用碳。二、氮源（细菌、酵母菌氮含

12、量大，霉菌含蛋量低，NH2基存在不提供能量）：指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。1、主要功能：构成微生物细胞和含氮的代谢产物，补充碳源，是细胞合成蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代谢物成分。2、有机氮源（有碳有氮）：含有蛋白质、肽类、游离氨基酸、糖类、脂肪、无机盐、生长因子。微生物对这类氮源的利用具有选择性。土霉素生产中玉米浆和氨基酸的利用率增加；选择有机氮时要注意品种、产地、加工方法对质量的影响。3、有机氮源：氨基酸、蛋白质水解物及尿素。4、无机氮源（无碳有氮）：铵盐、硝酸盐及氨气、氯化铵。5、实验室用培养基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水解物。6、工业化生产常用氮源

13、：硫酸铵、尿素、氨水、黄豆粉、花生粉、鱼粉、棉籽粉、玉米浆、酒精水及屠宰场废水等。氮源使用的一些相关问题：有机氮源和无机氮源应当混合使用；早期：容易利用易同化的氮源无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质；有些产物会受氮源的诱导和阻遏例： 蛋白酶的生产有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力；开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴的课题；三、无机盐和微量元素1、定义：是微生物代谢所需的重要物质。2、功能：构成菌体成分，作为酶的辅基或激活剂，调节微生物体内氧化还原电位、pH值及维持渗透压。无机元素对菌体生长的影响： 浓度降低促进生长；浓度提高抑制生长3、无机盐：磷酸、硫酸盐、氯化物

14、、钠、钾、钙、镁、铁。4、微量元素：一般参与酶的组成或使酶活化。微量元素缺乏，导致细胞生理活性下降，甚至停止生长。 P：构成菌体核酸、核蛋白及磷脂成分，组成高能磷酸化合物及许多酶的活性基，参与氧化磷酸化反应必须元素。Fe：是细胞色素及其氧化酶的激活剂。Zn（脱氢酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2辅酶 ）：是某些酶的辅酶或激活剂。Na：维持细胞渗透压。K：影响细胞膜透性。Ca：调节细胞透性作用。使用注意事项：1、对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理使用时注意盐的形式（pH的变化）

15、例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟四、生长因子、消沫剂、前体和产物促进剂1、生长因子：微生物生长必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以满足机体生长需要的有机化合物，如维生素。功能：构成辅酶的组成部分，促进生命活动进行。如维生素B族是各种酶的活性基的组成部分，没有维生素B，E就不能活动。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。 2、消沫剂：工业化生产中消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证

16、生产的正常运转。常用的消沫剂：植物油、动物油、高分子化合物。3、前体：在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。前体可自身合成（缬氨酸、半胱氨酸青霉素合成时用）；外源性前体（苯乙酸青霉素G）青霉素：分子量356 苯乙酸:分子量136 作用：前体有助于提高产量和组份 用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率4、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加

17、剂。 促进剂提高产量的机制尚不清楚。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；五、水：是培养基的主要组成成分，是构成菌体细胞的主要成分，是营养物质传导介质。功能：水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的，并且水直接参与代谢作用中的许多反应。对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻。对于常规发

18、酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。六、 影响培养基质量的因素工业发酵过程中，生产水平波动大，菌体代谢异常等现象。1、原材料质量的影响2、水质的影响3、灭菌的影响4、其他影响因素 第三节 发酵培养基的设计和优化一、培养基成分选择的原则 菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导1000.22.0、合适的C、N比、pH的要求 二、培养基实验设计：培养基成分的含量最终都是通过实验获得的；合理的实验方法：多因子实验；多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等；在筛选培养基中使用的原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法：单因子试验法、正交试验设计和均匀试验设计。1、单因子试验法：适用培养基组成和单

19、一营养成分的选择（费时，准确性低）2、均匀试验法：试验点均匀分散特点，实验组数与因素的水平数相同，试验结果分析采用计算机对试验数据进行多元回归系统处理，求得一回归方程定量预测最优的条件和结果，最佳培养基组成和浓度由菌种的生长情况、C/N代谢规律、pH值变化、产物合成速率决定。3、正交试验设计: 是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。三、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑； 的问题，初

20、步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 例1：类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化原培养基: 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：碳源：乙酸钠 0. 2%；氮源：氯化铵 0.2%； 酵母膏0.03%；无机盐: 复合无机盐0.05%例2：正交设计确定优化的配方 例3： 发酵培养基改进后培养基的发酵结果；摇瓶水平到反应器水平的优化

21、配方；摇瓶、反应器培养基研究的两个层次；摇瓶培养基设计的第一步；反应器最终的优化的基础配方 第三章 工业发酵的染菌及灭菌第一节 发酵染菌的危害发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。 所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。一，染菌对不同品种发酵的影响青霉素；疫苗；柠檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制剂二，不同种类的杂菌对发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌

22、的危害大；链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大；四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大；柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大；谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大；三，不同染菌时间对发酵的影响种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌及发酵后期染菌。四，不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性；空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐；培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性；设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大；五

23、，染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加；造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率；对提取的影响有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。六，染菌对三废

24、处理的影响使过滤后的废菌体无法利用；发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间第二节 发酵过程中染菌的检查判断一、染菌的检查与判断 目前生产上常用的杂菌检查方法有：显微镜检查：染色 ； 镜检平板划线检查：到平板空培养待测样品划线培养观察。酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察1、显微镜检查（镜检）：革兰氏染色法2、平板划线培养或斜面培养检查法3、肉汤培养检查法判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据无菌试验的目的：1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底；2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入；3，了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角；二，各种

25、检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确；三，杂菌检查中的问题检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据；平板划线和肉汤培养应做三个平行样；要定期取样；酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去；取样时防止外界杂菌混入的措施；表4-1四，发酵异常现象判断是否染菌 除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌溶解氧、pH值、尾气

26、中CO2含量1、发酵异常现象判断是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌体酶活力。溶氧浓度（谷氨酸发酵时）谷氨酸发酵时止常利J异常的溶解氧曲线正常发酵溶解氧曲线；异常发酵溶解氧曲线；··一异常发酵光密度曲线发酵初期：菌体适应期溶氧浓度不变耗氧量 染好氧杂菌溶解氧接近于0发酵中期：菌体对数生长期溶氧浓度耗氧量 染厌氧杂菌溶解氧耗氧量发酵后期：菌体衰老期溶氧浓度耗氧量 2）二氧化碳的含量杂菌染菌糖耗二氧化碳含量；噬菌体染菌糖耗二氧化碳含量耗气性发酵排气中二氧化碳含量与糖代谢有关。第三节 发酵染菌和染菌原因分析一、发酵染菌率发酵染菌率：定义：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数

27、之比。 总染菌率（一年内） = 发酵染菌批数 / 总投料批数 ×100%发酵染菌率以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消后的重复染菌的罐批（次）在内。设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。操作染菌率：统计操作工的染菌率，分析染菌原因，考核操作工灭菌操作技术水平。二、发酵染菌和染菌原

28、因分析 避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。 如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。专心-专注-专业1、国外一抗生素发酵染菌原因的分析 2、国内一制药厂发酵染菌原因的分析 国外一抗生素发酵染菌原因的分析国内一制药厂发酵染菌原因的分析染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%种子带菌9.64蛇管穿孔

29、5.89外界带入杂菌（取样、补料带入）8.20操作违反规程1.60接种时罐压跌零0.19接种管穿孔0.39设备穿孔7.60种子带菌0.60培养基灭菌不透0.79阀门泄漏1.45空气系统带菌26.00原因不明35.00空气系统带菌19.96罐盖漏1.54停电罐压跌零1.60搅拌轴密封泄漏2.09其他设备漏10.13接种11.00泡沫冒顶0.48操作问题10.15蒸汽压力不够或蒸汽量不足0.60夹套穿孔12.36原因不明24.91管理问题7.09 3，从染菌的规模幅度来分析染菌原因 大批（多个）发酵罐染同一种菌：空气系统问题 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可

30、能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 4，从染菌的时间来分析发酵前期：种子、无菌空气 、培养基、设备灭菌不彻底、 接种操作不当、设备或管道有死角。发酵后期：中间补料、操作不合理问题、设备渗漏。5，从染菌的类型来分析浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管、夹套渗漏或水污染。 耐热性芽孢杆菌：死角、培养基、设备灭菌不彻底。 球菌、酵母、不耐热无芽孢杆菌：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的、种子带菌、

31、设备渗漏、操作问题。 霉菌：无菌室及灭菌不彻底或操作不严格问题第四节 发酵杂菌污染途径及防止一、种子带菌的原因及防止1、种子带菌原因问题培养基及用具灭菌不彻底，灭菌温度达不到要求。菌种在移接过程，操作和管理不当。菌种在培养过程或保藏过程中外界空气和杂菌进入（试管有长度、紧度，应恒温，严检）无菌室的无菌条件不符合要求。2，种子带菌的防止种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。（1）无菌室无菌室的基本要求：无菌室面积不宜过大，一般约46米2高约26米。 为了减少外界空气的侵

32、入，无菌室要有13个套间(缓冲过道) 无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成形 。室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。 无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。化学灭菌药剂： 用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主) ： 75%酒精;0.25%新洁而灭(季胺盐)；0.61%漂白粉；0.5%石炭酸；0.5%过氧乙酸；1%煤酚皂(来苏尔)；0.5%高锰酸钾；300单位毫升土霉素；50单位毫升制霉菌素等 。用作熏蒸：甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2-3克)。 （2）培养基要求无原料性状（颗粒、结块等）及原料无发霉变

33、质现象出现。（3）种子培养基灭菌灭菌操作时需要注意排气管是否畅通 ；固体培养基可采用两次灭菌的方法；通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121ºC所需的时间与瓶内培养基的体积有关 。二、设备灭菌不彻底：1、实罐灭菌未充分排除罐内空气，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到要求开排气阀使蒸汽透过所有管线彻底灭菌。2、培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，达不到灭菌温度自控装置。3、设备管道存在“死角”，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定到达的局部灭菌部位形成不彻底灭菌部位“死角”。4、设备渗漏引起染菌及防止：砂眼（腐蚀）裂缝（振动）选优质材料。5、操作问题：移料+罐压=0，外界空气进入+泡沫

34、顶盖+压缩空气压力突降+发酵液倒流入空气过滤器高度责任心+管理+高素质。三、发酵设备、管件的渗漏与配置设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。1，设备渗漏的原因发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀；设备加工不良；弯管时，弯头处管壁变薄；焊接不良；2，盘管渗漏的防止放罐后要认真清洗发酵罐；控制冷却水质量，降低其中氯离子含量；对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙； 3，空气分布管渗漏的防止空气带菌：空气净化设备、流程、过滤介质选用和装填、介质灭菌管理等。4，

35、罐体渗漏的防止5，管件的渗漏 与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样，而有其特殊的要求。四、发酵罐与管件的死角 所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。1，法兰连接的死角 发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不

36、平现象就会造成死角(图78c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角(图78a、b)。 2，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角 3，不锈钢衬里的死角 4，接种管路的死角 采用种子罐时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如下图所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀1的半截上装设旁通，焊上一个小的放气阀，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。 5，排气管的死角 罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。另外排

37、气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例，不宜过大或过小。 6，不合理补料管配置造成的死角 7，压力表安装不合理形成的死角五、染菌后的挽救措施 种子培养或种子罐中发现污染 。发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。 中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。 有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年

38、4!10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。(2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量：0.120.17L/m3罐体积。(3)对染菌种子罐罐内放水灭菌，灭菌后水量占罐体的2/3以上。细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。六、制服染菌对发酵过程的要求1、对空气净化系统的要求。2、对蒸汽要求。3、对设备的要求。4、对工艺的要求。第五节 灭菌培养基+设备+空气灭菌防止发酵过程染菌+保证生产。染菌：营养物质消耗+抑制产生菌生长+改变培养液性质+产生破坏代谢产物的酶类。 一、 灭菌的方法灭菌：指用化学的或物理

39、学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。工业常用的灭菌方法：化学物质灭菌；热灭菌；辐射灭菌；过滤介质除菌。（一）、消毒和灭菌的区别： 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。（杀死引起感染的微生物）或（用物理、化学方法除去表面的致病微生物）灭菌：用物理、化学方法杀死或除去环境中所有微生物。（杀死一切微生物）消毒不一定灭菌（无菌态）；灭菌无菌态（可消毒）（二）、常用的灭菌方法1、干热灭菌法干热灭菌法 一般认为繁殖型细胞在100 以上干热1小时即被杀死。耐热性细菌芽胞在120以下长是时间加热也不死亡，介140前后则杀菌效率急剧增长。所以，关于干热灭菌

40、条件，有的药典规定为1801小时以上，有的药典规定为16017024小时，此仅是大至的标准而已.2、湿热灭菌1）湿热灭菌定义：借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。2）优点：来源容易，操作无毒。穿透力强，灭菌彻底。具有很大的潜热，蒸汽冷却的水有利于灭菌。蒸汽输送可借助于本身的压力。经济快捷。3）湿热灭菌的原理：在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热而发生不可逆的凝固变性。3、辐射灭菌1）定义：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。2）紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用的波长范围：250270nm杀菌率高。3）放

41、射性同位素CO60，密封包装灭菌（产品成品包装的灭菌）4、化学物质灭菌1）定义：化学物质用于消毒和防腐。2）作用：药物易与细胞中的某些成分起化学反应，使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性而杀灭微生物。3）适用范围：药残难除，易于蛋白质产生化学反应，不适合培养基灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。4）化学药品：高锰酸钾：氧化蛋白质、氨基酸，浓度为0.10.25%;次氯酸钠（漂白粉）：强烈氧化作用;75%酒精：细胞脱水作用，使乙醇分子进入蛋白质的肽键空间，引起蛋白质变性或沉淀。范围为皮肤和器具表面杀菌。新洁尔灭和杜灭芬：阳离子表面活性剂与微生物菌体表面结合，引起菌外膜损伤和蛋白变性。对芽孢无灭

42、菌作用。范围：器具和环境。使用浓度：0.25%（5%加水稀释20倍）。甲醛：还原作用杀菌，与蛋白质氨基结合使其变性。37%甲醛溶液称为福尔马林。范围：无菌室和车间空间消毒。戊二醛：应用广泛，使用范围为碱性条件下杀死孢子，浓度为2%。范围：器具和仪器。过氧乙酸：强氧化剂，对营养细菌、真菌（孢子）、病毒起作用；杀菌浓度0.01%；无害浓度0.2%；-40仍可杀菌，有腐蚀性。酚类：有毒性，水溶性差，污染环境。浓度为0.10.15%，15分钟灭大肠杆菌。抗生素：抑菌灭菌剂，有选择性（细菌）。二 培养基湿热灭菌（一）、影响培养基灭菌的因素1、培养基成分：油脂越高，糖类越高，蛋白质的浓度越高，都会使微生物

43、的耐热性增高。2、pH值：pH值为6.08.0，微生物耐热性好；pH值<6.0灭菌时间3、培养基中的颗粒：颗粒越大，灭菌越难，反之，越易。颗粒小于1mm 培养基无影响。4、泡沫：培养基形成泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热量很难穿透去杀灭空气中的微生物。解决办法加消泡剂。（二）、培养基灭菌方式1、分批灭菌（实罐灭菌）：将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺称为分批灭菌或实罐灭菌。适用于小批量生产，固体颗粒培养基，产泡沫多时采用。通常必须灭菌条件：110-130，5-20分钟，培养

44、液灭菌采用高温短时加热的方式。2、连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程称为连续灭菌。 使用于大规模生产、小颗粒液体培养基，产少量泡沫。 利用板式换热器进行连续灭菌的流程图，其流程的能量利用较合理。 三 空气除菌（一）、空气中的微生物：好氧性微生物的生长繁殖和形成代谢产物都需要消耗氧气。1、大气空气：尘埃+沙土+各种各样的微生物;2、空气中悬浮的微生物一般为：103104个/立方米;3、空气除菌的目的为除去或杀灭空气中的微生物;4、空气中的微生物：细菌、细菌芽孢、酵母、霉菌、放线菌及噬菌体。空气在引进发酵罐之前必须进行严格处理，除去其中含

45、有的微生物和其他有害成分;（二）、空气除菌方法：1、加热灭菌：可用蒸汽、电能、空气压缩机产生的热量进行灭菌。2、电除尘：含有灰尘和微生物的空气通过高压气流电场，正极电场强度>1000V/cm2时，气体产生电离，产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体，被捕集与电极上。3、介质过滤除菌：经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌目的。1）绝对过滤：介质的之间的空隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气的微生物被滤除。节约能量和时间，操作简便。微孔滤膜（孔径小于0.5nm）；纤维介质：纤维素膜微孔滤膜2）深层过滤：以纤维状（玻璃纤维）+颗粒状（活性炭）介质过滤

46、层 用超玻璃纤维，聚乙烯醇等为介质的过滤层3）影响介质过滤效率的主要因素：颗粒性质、介质性质（介质填充长度L、介质填充密度和介质纤维直径）和气流速度.4）空气过滤器：A、纤维状或颗粒介质过滤器：特点：过滤层厚度L体积V压力降P操作麻烦。介质：棉花（上下）、玻璃纤维、活性炭（中）B、过滤纸类过滤器：以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。特点：阻力、压力降低，强度下降;介质：超细玻璃纤维、聚乙烯醇制成旋风式或套管式;5）、空气过滤除菌的工艺流程 空气净化工艺流程图1空气吸气口；2粗过滤器；3空气压缩机；4一级空气冷却器；STh级空气冷却器；6分水器；7空气贮罐；8旋风分离器；9丝网除沫器；10空气加

47、热器8 11总空气 过滤器；12分过滤器无菌空气制备控制要点：提高空气入口洁净度（加粗过滤和增高吸气口高度） 防压缩空气中夹带的油水，影响无菌空气质量（压缩机出口空气要升温至120150）第四章 生产菌种的培养与保藏 第一节 种子制备的过程（菌种的扩大培养）种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 种子扩培的目的：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发

48、酵时间、保证生产水平。一、工业对微生物的要求1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长并生成所需的代谢生产物，产量高。2、可以在易于控制的培养条件下，迅速生长和发酵，且所需酶活力高。3、生长速度和反应速度较快，发酵周期短。4、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。5、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体。6、菌种纯粹，其不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。7、菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保证安全。二、工业常用的微生物三、种子制备的过程大致可分为： 实验室种子制备阶段; 生产车间种子制备阶段

49、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。 四、孢子制备孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。（一）放线菌孢子的制备1、放线菌的孢子培养常采用：琼脂斜面培养基2、培养基成分要求：C：1%；N：0.5%C造成生理酸性环境孢子形成;N菌丝繁殖孢子形成干燥和限制营养是直接或间接诱导孢子形成的原因。3、放线菌斜面培养：T：28；514天。4、放线菌发酵生产工艺过程 节约菌种用量，易控孢子质量菌种

50、母斜面（孢子）子斜面（孢子）摇瓶种子（菌丝）种子罐发酵罐 防菌种变异5、成分：麸皮、豆汁、蛋白胨、无机盐（二）霉菌孢子的制备1、霉菌的孢子培养成分：大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品。2、霉菌培养条件：T：2528，培养414天。（三）、细菌孢子的制备：1、细菌的斜面培养基：多采用碳源限量而氮源丰富的配方。CN牛肉膏、蛋白胨2、培养条件：T多37；T少28；培养12天；产孢510天五、种子制备生产车间种子制备 ：实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气

51、，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1、一级种子：孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。2、二级种子：把一级种子转入到体积较大种子罐内发酵，经培养后形成大量菌丝，这样的种子称为二级种子。3、二级发酵：把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。4、三级发酵：把二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。（50吨罐）5、种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。6、种子罐级数：决定菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子罐级数取决于：

52、种子的性质（生长繁殖性能）； 孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； 孢子发芽及菌丝繁殖速度； 发酵罐中种子的最低接种量； 种子罐与发酵罐的容积比；细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子7、确定种子罐级数需注意的问题：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产

53、率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 8、种子制备的目的：形成一定数量和质量的菌体。9、发酵目的：获得大量发酵产物。六、种子扩大培养1、菌种扩大培养的目的：就是要为每只发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。2、种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养菌，而且要获得活力旺盛，足够量的培养物。七、工业微生物的培养类型1、工业微生物的培养方法：静置培养、通气培养 静置培养法：将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。通气培养法：其生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌属多，它的生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。2、种子扩大培养阶段1)液体培养法：试管+摇床;2)表面培养法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盘;3)固体培养法：三角瓶、培养皿;A、固体培养：曲法培养：浅盘固体培养和深层固体培养（固体曲霉活性高）深层固体通风制曲：在曲房周围用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温度和湿度，灵活调节适应菌种