第三节免疫检测技术的基本原理

1、 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原 . 将免疫反应与现代测试技术结合 超微量的检测 高度的灵敏性 高度的特异性 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术概念：颗粒性抗原概念：颗粒性抗原( (细菌、红细胞等细菌、红细胞等) )与相应抗与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。称为凝集反应。1.1.直接凝集反应直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。性结果。玻片直接凝集法：定性试验玻片直接凝集法：定性

2、试验试管直接凝集法：半定量试验试管直接凝集法：半定量试验+ 玻片直接凝集试验玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上( (如如RBC, RBC, 乳胶颗粒乳胶颗粒) )，再与相应抗体或抗，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。原反应，出现凝集为阳性结果。 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。验等。+待检样品待检样品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳胶颗粒或乳胶颗粒反应凝集物反应凝集物 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知先将待

3、检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (HCG (妊娠诊断妊娠诊断) )步骤步骤1 1：将已知抗体：将已知抗体与待检标本混匀与待检标本混匀 步骤步骤2 2：加入抗原吸：加入抗原吸附的乳胶颗粒混匀附的乳胶颗粒混匀抗 原 吸 附抗 原 吸 附乳胶颗粒乳胶颗粒结果判断：结果判断：不 凝 集 为不 凝 集 为阳性结果阳性结果已知抗体已知抗体待检标本待检标本2.沉淀反应沉淀反应 概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。现

4、沉淀物称沉淀反应。类型：类型：单向免疫扩散单向免疫扩散免疫比浊法免疫比浊法双向免疫扩散双向免疫扩散对流免疫电泳对流免疫电泳 单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验 对流免疫电泳对流免疫电泳测吸光度测吸光度计算抗原计算抗原或抗体的或抗体的含量含量抗体抗体抗原抗原免疫复合物的免疫复合物的浓度与透射光浓度与透射光的衰减呈正相的衰减呈正相关关免疫比浊法原理免疫比浊法原理3.中和反应中和反应 如抗如抗“O”试验试验4.免疫标记技术免疫标记技术 概念：用荧光素、酶、同位素等概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为

5、免疫标记技术。常用抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。放射免疫检测技术等。 特点：敏感、特异、快速，能定特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。性、定量、定位。 酶免疫标记技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 免疫金标记技术 1971年瑞典学者年瑞典学者Engvail和和Perlmann,荷兰学者荷兰学者Van Weerman和和Schuurs分分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法附测定法

6、(enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)酶及其底物酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原, , 半抗原半抗原在交联剂作用下联结的产物。是在交联剂作用下联结的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应. .酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物

7、酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +

8、噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法戊二醛交联法戊二醛交联法 (一步法）一步法）抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶戊二醛交联法（二步法

9、）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）

10、双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（

11、抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定 间接法是检间接法是检测抗体最常用的方测抗体最常用的方法，其原理为利用法，其原理为利用酶标记的抗抗体以酶标记的抗抗体以检测已与固相结合检测已与固相结合的受检的受检抗体抗体，故称，故称为间接法。为间接法。（二）

12、间接法（二）间接法 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法间接法)包被固相载体包被固相载体: : 用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定（三）竞争法（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于

13、抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体量测定，也可用于测定抗体 。用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量 对照管由于只加酶标抗原，与对照管由于只加

14、酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。加入底物后显色反应较弱。 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素简曲霉毒素 ）

15、饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ） 甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不绿（草不绿（ AlachorAlachor ）

16、、）、 西维因（西维因（ CarbarylCarbaryl ）、）、 多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（ CaptanCaptan ）等）等。农药的检测农药的检测： 大肠杆菌检测 沙门氏菌检测 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌 转基因成份的检测：如转基因玉米中转基因成份的检测：如转基因玉米中中的中的cry9e蛋白蛋白转基因大豆中的转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质蛋白质肉制品的掺假检测：肉制品的掺假检测： 以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种种畜禽熟肉制品，

17、包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为掺假率为1%时即可检出时即可检出食品其他检测食品其他检测：荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的ICIC可可散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和定位。定位。常用的荧光素常用的荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)、藻红蛋白、藻红蛋白(PE)(PE)等。等。常用的方法常用的方法

18、直接荧光法直接荧光法间接荧光法间接荧光法 免疫荧光技术免疫荧光技术Ag荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体特异性抗体组织切片组织切片Ag荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体组织切片组织切片待测抗体待测抗体荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜使用原理荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650 免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微

19、镜下可见黑的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。胶体金胶体金（colloidal gold）的制备一般采用的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸

20、、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。胶体金粒径胶体金粒径1%1%柠檬酸钠加入量柠檬酸钠加入量胶体金特性胶体金特性（nm)nm) （ml)ml)* *呈色呈色lmax(nmlmax(nm) )16162.00 2.00 橙色橙色51851824.524.51.50 1.50 橙红色橙红色52252241411.00 1.00 红色红色52552571.571.50.70 0.

21、70 紫色紫色535535* *还原还原100 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量优优 质质劣劣 质质其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2薄膜的质控点，是为金标二步法。ABLATERAL FLOW TEST STRIP OF VEDALAB30 将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物

22、，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。 兔抗鼠兔抗鼠IgG鼠抗鼠抗HCG单抗单抗金标鼠抗金标鼠抗HCG单抗单抗尿液浸湿标志线尿液浸湿标志线 手持端手持端斑点金免疫层析试验（一）斑点金免疫层析试验（一）斑点金免疫层析试验（二）斑点金免疫层析试验（二）尿样尿样阳性阳性弱阳性弱阳性阴性阴性无效无效质控线质控线测试线测试线免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图 阴性阴性阳性阳性无效无效 阳性阳性阴性阴性无效无效IFAIFAICAICA试剂形式试剂形式渗滤装置

23、及附渗滤装置及附加试剂加试剂试剂条试剂条试剂保存试剂保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步骤操作步骤3 35 51 1观察时间观察时间3 min3 min3 320 min20 min阳性反应颜色阳性反应颜色浓度浓度操作结束颜色操作结束颜色不变不变颜色逐渐加深颜色逐渐加深IFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW） 1、 罗立新, 缪珑, 潘力, 等. 快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究J. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(2): 154-156. 2、

24、 赖卫华, 熊勇华, 陈高明, 等. 应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究J. 食品科学, 2005, 26(5): 204-207. 3、 谌志强, 段惠莉, 王新为, 等. 大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测J. 中国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706. 4、 谢昭聪, 宋志强, 吕敬章, 等. 应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究J. 中国国境卫生检疫杂志, 2005, 28(3): 163-165. 5、 王中民, 李君文, 王新为, 等. 免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究J. 微生物学免疫学进展, 2001, 29(4): 45-47. 6、刘永德, 汪毅, 陈禹雷, 免疫金探针快速检测禽流感病毒研究J. 上海交通大学学报: 农业科学版, 2005, 23(3): 321-324.斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验ADCB阴性（未怀孕）阴性（未怀孕）阳性（怀孕）阳性（怀孕）加尿样加尿样除去滤器除去滤器加胶体金标记抗体加胶体金标记抗体加洗涤液加洗涤液结果判定结果判定免疫印迹法图解免疫印迹法图解SDS裂解裂解病毒病毒聚丙酰胺凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳-+ 95 68