非无菌产品微生物检查：控制菌检查法

1、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法概述 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 概述微生物限度检查法中的控制菌检查在药典一、二、三部附录中内容基本一致参照ICH协调案”非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查”进行修订。主要修订内容控制菌检查项目、培养基体系、 培养基适用性检查、 检查方法适用性试验、结果判断等。 供试液制备及实验环境要求 -同非无菌产品微

2、生物检查：微生物计数法。 -如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。 -中和剂或灭活剂的使用 使用了中和剂或灭活剂应确认有效性及对微生物的无毒 性并应确认供试液与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。 控制菌检查法 增修订内容 收载方式 检验项目 替代法的应用原则 结果判断方式 修订前微生物限度检查 修订后 非无菌产品微生物检查：微生物计数法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法非无菌药品微生物限度标准 收载方式 修订前 大肠杆菌、 大肠菌群、 沙门菌、 铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌 梭菌、 白色念珠菌 修订后 大肠杆菌、 耐胆盐革兰阴性菌、 沙门菌、 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌、 梭菌、 白色

3、念珠菌 检验项目 替代法的应用原则 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 修订前 增菌、分离(纯化)、生化试验适宜的鉴定试验。修订后 增菌、分离(纯化)、生化试验其它适宜方法进一步鉴定。 收载方式及结果判断方式 修订内容控制菌检查用培养基数量减少7个；在增菌过程，使用无选择性增菌培养基培养理由 污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的细菌得到修复，提高检出率。 培养基适用性试验培养基是绝大多数微生物试验的基础其质量是微生物试验成功关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供

4、优质培养基的保证。 培养基适用性试验 培养基的配制 可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，确保培养基的质量符合要求。 培养基适用性试验再验证如果其中有任一控制点发生变化,应重新进行培养基适用性检查。当检验结果出现异常或实验室质量控制需要，也可通过培养基适用性检查提供一定依据。 培养基适用性检查试验固体培养基或原料变质不应使用；配制培养基储存过程中发现 浑浊、变色、有菌生长、严重脱水等变化不应再使用。不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适

5、用性试验确定。除特殊规定外，培养基配制采用蒸馏水或纯化水，但应进行检测控制，如蒸馏水pH值应为57。尽量临用现配。 培养基适用性检查配制培养基的保存培养基灭菌后，不得在高压锅内过夜；固体培养基灭菌或融化后，放置不得超过8h；培养基于225 保存，但不应超过21 d；固体琼脂培养基 熔化再使用应不超过1次。 培养基适用性检查 菌种来源 国内外认可的菌种保藏中心。试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心 获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 104大肠埃希菌 CMC

6、C（B）44 102乙型副伤寒沙门菌 CMCC（B）50 094白色念珠菌 CMCC（F）98 001生孢梭菌 CMCC（B）64 941 菌种及菌液制备菌液制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌胰酪大豆胨肉汤或在胰酪大豆胨琼脂3035，1824h白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤2025， 23天生孢梭菌梭菌增菌培养基3035，置厌氧条件下培养2448小时 菌悬液的制备稀释剂 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。菌悬液的贮存若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保存在28

7、，在验证过的贮存期内使用。 菌液制备 阴性对照试验确认试验条件是否符合要求。稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应 进行偏差调查。 培养基适用性检查成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。菌株见表 培养基适用性检查控制菌检查 培养基 特性 试验菌株耐胆盐革兰阴性菌 肠道菌增菌肉汤 促生长能力 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂 促生长能力+指示特性 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌大肠埃希菌 麦康凯肉汤 促生长能力 大肠

8、埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 麦康凯琼脂 促生长能力+指示 大肠埃希菌大肠埃希菌 麦康凯肉汤 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 麦康凯琼脂 促生长能力+指示 大肠埃希菌 培养基适用性检查 沙门菌 RV沙门菌增菌肉汤 促生长能力 乙型副伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 促生长能力 乙型副伤寒沙门菌 +指示特性 三糖铁琼脂培养基 指示能力 乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力 铜绿假单胞菌 抑制能力 大肠埃希菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂 促生长能力 金黄色葡萄球菌 +指示特性 抑制能力 大肠埃希菌梭菌 梭菌增菌培养基 促

9、生长能 生孢梭菌 哥伦比亚琼脂 促生长能力 生孢梭菌白色念珠菌 沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力 白色念珠菌 +指示特性 沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力白 色念珠菌 念珠菌显色培养基 促生长能力 白色念珠菌 +指示能力 抑制能力 大肠埃希菌 培养基适用性检查 液体培养基促生长能力检查 接种不大于100cfu的试验菌在不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基管试验菌应生长良好。 固体培养基促生长能力 接种取菌悬液0.1ml），涂布于培养基平板上，在规定的温度及时间下培养 。 不长于规定的最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形 态特征应一致。 培养基适用性检查培养基适用性检查培养基

10、抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基。不短于规定的最长培养时间下培养。 试验菌应不得生长。 培养基指示特性检查取试验菌悬液各0.1ml涂布于培养基平板上在不长于规定的最短时间下培养， 被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 修订前 大肠菌群的验证，采取大肠埃希菌为验证菌株。 修订后耐胆盐革兰阴性菌检查方法，采取大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。 方法适用性试验试验菌 修订前验证方法取规定量供试液及10 100cfu试验菌接入增菌培养基中依相应的控制菌检查方法进行检查。当采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲

11、洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出接入增菌培养基中. 修订后适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤 ,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征 方法适用性试验 修订前 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释 法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供

12、试品的控制菌检查同时进行。修订后 若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性。如确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。 方法适用性试验结果判断 供试品检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。阳性对照试验试验方法 同供试品的控制菌，加菌量应不大于100cfu。应检出相应的控制菌。 供试品检查耐胆盐革兰阴性菌耐胆盐革兰阴性菌取代2010年版大肠菌群检查大肠菌群的定义是指在37生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧

13、的无芽孢杆菌。符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。 耐胆盐革兰阴性菌检查检验程序 供试液制备 同“非无菌产品微生物检查：微生物计数法制成1：10供试液，混匀。预培养 在2025培养，培养时间一般2小时,使供试品中的细菌充分恢复但不增殖。未检出试验取相当于1g或1mL供试品的上述预培养物接种至 肠道菌增菌肉汤中。3035，培养2448小时。划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置 3035，培养1824小时。平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性 耐胆盐革兰阴性菌检查定量试验1、取定量供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌 增菌肉汤中。303

14、5，培养2448小时。2、上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄 糖琼脂平板上。3035，培养1824小时。若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表2查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。 表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数各供试品量的检查结果每1g（或1ml）供试品中可能的菌数（N）0.1g/ml0.01g/ml0.001g/mlN103102N10310N102N10 供试品检查大肠埃希菌大肠埃希菌是肠杆菌科埃希菌属的代表种。大肠埃希菌是两端钝圆的短小直杆菌，（1.11.5）m(2.0 6.0)m单个或成对，革兰阴

15、性无芽孢，多有鞭毛培养最适温度为37可在15-46生长，兼性厌氧。 修订前取1:10供试液至胆盐乳糖增菌（大肠、金葡）18-24hMUG培养基（大肠）5h、24h MaC琼脂（大肠 、指示） 18-24h 修订后取1:10供试液至TSB（大肠、 金葡、）18-24hMaC肉汤 （大肠、 金葡）42-44 24-48h MaC 琼脂 （大肠 ）18-72h 方法适用性试验 大肠埃希菌检查检验程序 取供试品，照附录“微生物计数法”制成1：10供试液。取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积 的胰酪大豆胨肉汤中。 3035培养1824小时。 取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯肉汤中

16、。 4244培养2448小时。取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平 板上。3035培养1872小时。结果判断 -若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验, 确证是否为大肠埃希菌；-若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结 果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。 供试品检查 沙门菌 沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体 通常（0.40.9）m(13) m，两 端钝圆。需氧或兼性厌氧，1042皆可 生长，最适温度37。 检验程序 修订前 营养肉汤供试液（18-24h )TTB (沙门、金葡） 18-24hSS / MaC 琼脂（沙门、金-）18-48h RV

17、氯化镁孔雀绿沙门菌增菌肉汤XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂SS： 沙门、志贺菌属琼脂XLD 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂修订后 TSB 供试液（ 18-24h ）RV肉汤（沙门、金葡）18-24hXLD琼脂（沙门、 指示）18-48h 沙门菌检查 沙门菌检查沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上生长良好，菌落为 红色、中心有或无黑色。 鉴定试验 挑选疑似菌落穿刺接种于三糖铁琼脂培养基高层 斜面上培养1824小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上有疑似菌落生长，三糖铁琼脂培养基 斜面为红色、底层为黄色 或斜面黄色、底层有黑色应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否

18、为沙门菌。如果平板上没有菌落生长, 或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性三糖铁琼脂培养基斜面未见红色、底层未见黄色 或斜面黄色、 底层无黑色 判供试品未检出沙门菌。 铜绿假单胞菌形态特征铜绿假单胞菌为革兰阴性、直或微弯曲的杆菌，其菌体的长短不一，短的为球杆状，长为丝状，大小（0.51.0）m(1.53.0)m。除在硝酸盐培养基中以外都是专性好氧。最适生长温度为35，在42能生长，4不生长。 检验程序 修订前 取1:10供试液至BL 18-24h 溴化十六烷基三甲铵琼脂18-24h绿脓菌素测定用培养基24h修订后 取1:10供试液至TSB （18-24h ) 溴化十六烷基三甲铵琼脂18-72h 铜绿假

19、单胞菌检查 铜绿假单胞菌检查检验程序 供试液制备 取供试品，照附录“微生物计数法” 制成1：10 供试液。取相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积的胰酪 大豆胨肉汤中3035培养1824小时。 接种 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平 板上。3035培养1872小时。 鉴定试验 取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。确证试验 平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。 金黄色葡萄球菌形态特征金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属。菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，直径0.5-1.5m，平

20、均直径金黄色葡萄球菌对生长的营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37，最适生长pH为7.4。 修订前 1:10供试液至营养肉汤或亚碲酸盐肉汤 18-24h ，48h甘露醇氯化钠琼脂24-72h抑制能力：大肠埃希菌接种量不大于103 ，接种量过大，大肠埃希菌可生长修订后甘露醇氯化钠琼脂18-72h 抑制能力：大肠埃希菌接种量不大于103 ，接种量过大，大肠埃希菌可生长。 金黄色葡萄球菌检查 金黄色葡萄球菌检查检验程序 取供试品，照附录“微生物计数法”制成1：10供试液。相当于1g或1mL供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀。3035培养1824小时。修订前 为亚碲酸钠（钾）肉汤或营养肉汤选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上。3035培养1872小时。 金黄色葡萄球菌检查结果判断若甘露醇氯化钠琼脂平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证。若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或 疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 梭菌为一大群厌氧或微需氧的粗长芽孢杆菌