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文档简介
1、鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价目的目的1、掌握鸡新城疫的临诊要点。、掌握鸡新城疫的临诊要点。2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。免疫监测技术。 内容内容1、鸡新城疫的临诊要点。、鸡新城疫的临诊要点。2、鸡新城疫的实验室诊断。、鸡新城疫的实验室诊断。 NDV的分离及鉴定;的分离及鉴定; NDV毒力的鉴定毒力的鉴定3、鸡新城疫的免疫效果评价、鸡新城疫的免疫效果评价鸡新城疫的免疫监测鸡新城疫的免疫监测 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)血凝试验(HA)和血凝抑制试验 (HI)HA和HI的原理HA试验:许多病毒表面有血凝素,能与各种动物的红细胞
2、表面受体结 合,而出现红细胞凝集现象,简称为病毒的血凝现象 。2.HI试验:病毒的红细胞凝集现象,可以被特异性免疫血清所抑制,称HI试验。一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【材料】【材料】 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 1份 0.5鸡血球悬液 1管 生理盐水或PBS 1瓶 96孔微量血清盘 1块 微量加样器 1支 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【方法与步骤方法与步骤】(一)制备鸡红细胞悬液:(一)制备鸡红细胞悬液:1.用注射器抽取抗凝剂。 2.用上述注射器,采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。3.混匀,加生理盐水适量,洗涤离心,共离心三次(第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 5
3、分钟)洗去血清及白细胞。 取纯红细胞0.6ml,加生理盐水稀释99.4ml,即成1%的鸡红细胞悬液。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)(二)加样二)加样1. 在在96孔微量反应板上进行,自左至右各孔加孔微量反应板上进行,自左至右各孔加50 L生理盐水。生理盐水。2. 于左侧第于左侧第1孔加孔加50 L病毒液,混合均匀后,吸病毒液,混合均匀后,吸50 L至第至第2孔,依次倍比稀释至第孔,依次倍比稀释至第11孔,吸弃孔,吸弃50 L;第第12孔为红细胞对照。孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液50 L,在振荡器上振荡,室温下静置后观察结果
4、。在振荡器上振荡,室温下静置后观察结果。一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【病毒血凝试验的操作方法(单位:【病毒血凝试验的操作方法(单位: L)】)】 孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.6%红细胞505050505050505050505050 微型振荡器1min,静置30min 弃50结果观察+-以以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价,即为一个凝集单位凝集的病毒最
5、大稀释度为该病毒血凝价,即为一个凝集单位一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【 结果判定结果判定 】置于振荡器上振荡1分钟,静置后30 min开始观察结果,待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集,沉于孔底,平铺呈网状,即为100% 凝集(+),不凝集者(-)红细胞沉于孔底呈点状。以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价,即为一个凝集单位。从表4-1看出,该新城疫病毒液的血凝价为1:128,则l:128为1个血凝单位,1:64、l:32分别为2、4个血凝单位,或将128/4=32,即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 【材料】 除血球凝集试验
6、所用材料外,血清取鸡免疫血清。 鸡群卵黄抗体的制备鸡群卵黄抗体的制备1.1.取鸡蛋卵黄取鸡蛋卵黄20ml20ml,加入等量生理盐水,加入等量生理盐水,振荡,摇匀。振荡,摇匀。2.2.加入等量氯仿加入等量氯仿40ml40ml,振荡,振荡3030分钟。分钟。3.3.取振荡的卵黄液取振荡的卵黄液300030004000rpm304000rpm30分钟。分钟。4.4.取上清液作为抗体检测材料取上清液作为抗体检测材料二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【方法】1. 根据HA试验结果,确定病毒的血凝价,配制出4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行,用固定病毒稀释血清的方法,先在第1孔加50L生
7、理盐水。3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。4.第孔加被检鸡血清50L,吹吸混合均匀,吸50L至第2孔,依此倍比稀释至第10孔,吸弃50L,稀释度分别为:1:、1:4、1:8 ;第12孔加新城疫阳性血清50L,作为血清对照。振荡混合均匀,置室温中作用20min 。5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L,振荡混合均匀,室温下静置30-40min后观察结果二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 孔 号 滴度lg2材料 12345678910111212345678910病毒对照对照8单位病毒504单位病毒50505050505050505050生理盐水50被检鸡血清50505050505050505050 弃500.6%红细胞505050505050505050505050 震荡混匀,室温30-40min结果观察-+ 【病毒血凝抑制试验的操作方法(单位:病毒血凝抑制试验的操作方法(单位: L) 】以以100抑制凝集(完全不凝集)的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价,即抑制凝集(完全不凝集)的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价,即HI效价。效价。二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 【结果判
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