转基因番茄口服疫苗的研究进展.docx

1、DOI:10.3969/cmba.j.issn.l673-713X.2O1O.O1.O13转基因番茄口服疫苗的研究进展郑卿，郭书巧，葛才林，倪万潮第1例转基因烟草表达链球菌变异株SpaA(surfaceproteinantigenA)蛋白疫苗的成功研制'开启了利用植物表达动物病原抗原蛋白的新纪元.1992年，Mason等提出了“转基因植物疫苗”的概念，标志着植物口服疫苗成为新药研发新途径的全面展开。口服转基因植物疫苗不仅能诱导机体产生全身性的体液免疫和细胞免疫应答，还能同时激活黏膜免疫。曰服疫苗到达肠内黏膜诱导部位之前经过同内的不利环境时必须受到保护，否则有可能被降解而失去免疫原性。而

2、植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可保护细胞内的疫苗免受消化道酸性环境和各种酶的降解，使表达的疫苗在小肠内缓慢歼放，被小肠上皮的M细胞(membraneceil)识别并转运，APC(antigenpresentingcell)细胞加递呈，使机体产生黏膜和企身性的免疫反应，发挥对机体的全面保护作用(七因此，利用植物作为抗原表达和递送的载体已经成为当今生物技术研究的热点，并取得了长足的发展。但是食物的加工对目标蛋白有一定的破坏，并可能影响其免疫原性。番茄<Lycopersiconesculenturn)作为具备良好加工特性的蔬菜，具有全世界的普及性，其口感好，营养丰富，是植物口服疫苗的理想载体c

3、因此，番茄作为生物反应器来生产可食性疫苗具有较好应用前景。1番茄口服疫苗的优点番茄作为外源蛋白的表达系统，除只有植物所共有的优点外还具有以下鲜明的特点：Q)番茄是全球广泛栽培的一种植物，不易受地域条件的限制，因此有利于进行规模化生产，降低生产成本。(2)番茄作为-种茄科植物的模式植物，在遗传学和分子生物学方面有着较为深入的研究，许多成熟的技术可以直接应用于番茄的研究中，这为番茄作为生物反应器技术平台的建立创造了有利条件。表达外源蛋白的转基因番茄果实可以宜接食用，在预防或治疗疾病的同时也可以增加营养。还可以将果实制成粉末，进行有效以及长时间的储存，这样在植物疫苗和其他约用蛋白用于疾病的预防或治疗

4、时，不需要经过繁杂的分离以及纯化步骤，不仅降低了成本和患者的负担，而且使患者能够从情感上易于接受。2番茄口服疫苗的研究进展利用转基因技术，番茄可被用于生产在医学上有页要应用价值的酶或蛋白成。口前研究人员已经利用番茄作为生物反应器，在生产药用蛋白、抗体、曰服疫苗以及其他I：业用品方面做了广泛的尝试，多种外源基因己经成功转入番茄，并表达出有效的蛋白质，小鼠实验吐"证明，这些转基因番茄表达的蛋白可以引起有效的免疫反应，取得了可喜的成果，研究较多的番茄口服疫苗主要有以卜几种：乙肝病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、霍乱弧萌疫苗、狂犬病病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。2.1乙肝病毒转基因番茄口服疫苗乙肝

5、病毒(hepatitisBvirus,HBV)是引发严重慢性肝炎的病原，目前乙肝病毒疫苗的获得是利用酵母细胞通过发酵途径产生的，属于生物技术产物F的亚单位疫苗。HBV在肝DNA病毒家族中属于双链DNA病毒。HBV基因组包括四个基W：pohenv>precore和X,分别编码病毒的DNA聚合南、外壳蛋白、前核心区蛋白和X蛋白。乙肝病毒表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg)的主要成分蛋白即是由env基因编码的S蛋白。由于HBsAg颗粒可以使人体产生专一的抗体，能对病毒的感染起预防作用，因此科学家在进行疫苗研制时都将编码乙肝病毒表面抗原的基因作为研究

6、的重点。Shchelkunov等将表达人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus.HIV)的表位ENV、GAG和编码HBsAg的基因融合，以CaMV35S为启动*构建载体，获得转基因番茄。用表达融合蛋白的转基因洛茄果实干粉每2周饲喂一次小鼠，每7d取一次全血检测，结果表明，小取对两种病毒均产生免疫反应，说明融合基因可以足并:地表达引起免疫反应的抗原。Lou等四为了使乙肝病毒表面抗原能在转基因番茄中更好地表达，将烟草致病相关蛋白(tobaccopathogenesis-relatedproteinS)PR-S信号肽融合到改良目的基因的5-端，同时将表达氨基酸序列SEKD

7、EL的基因融合到3-端，利用果实特异性表达的倍动子2A11,使HBsAg大蛋白基因在转基因番茄的果实中特异表达。目的蛋白的最高表达水平占转基因番茄果实可溶蛋白总数的0.02%,并且在成熟果实中的表达量是其他组织的65171倍。用免疫金标记方法检测到重组HBsAg大蛋白在内质网附近累积，并且证明所捕获的HBsAg大蛋白微粒仍旧可以保持与人血清中获得的HBsAg具有相同的物理性质，基金项目：国家转基因专顼(2OO8ZXO8OO5-OO1)作者单位：225009扬州大学生物技术学院(郑卿、葛才林)；210014南京，江苏省农业科学院生物技术所(郑卿、郭书巧、况万潮)通讯作者：倪万潮，Email：ni

8、wc；幼才林，Email：gccailinlO®收稿日期：2009-09-14且具有很高的免疫原性，据称这是首次在植物中表达了HBsAg大蛋白。近来，He等在构建工程载体时采用E8启动子，在番茄中表达了乙肝病毒表面抗原(HBVS2+S/HBsAgM),E8启动了使得抗原仅在成熟的番茄果实中表达。何乃彦等(将HBsAg/截短型丙肝病毒(hepatilisCvirus,HCV)核心蛋白融合基因重组到植物表达载体pBin438的强组成型启动子CaMV35S及增强子下游，构建表达载体pBin438BE,并转化番茄。从转基因番茄植株中提取总蛋白，经Dotblot实验证明HBsAg/桩短型HCV

9、核心蛋白的融合蛋白在转基因番茄中得到了表达。王逸群和李田"3】将HBsAg基因导入番茄，成功获得了转基因阳性植株。果洪宇等n新也成功将HBVS/HEVORF2融合基因转入番茄，并获得转基因阳性植株。2.2口蹄疫病毒转基因番茄口服疫苗口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)属于小RNA病毒科曰蹄疫病毒属，FMDV基因组的中部是一个大的开放阅读框，编玛一多聚蛋白，开放阅读椎由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成。多聚蚩白经过初级裂解形成L-P1-2A、2BC和P3三种前体蛋白，16个基基酸的多肽2A催化P1-

10、2A从2BC连接处顺式切割；次级裂解由3C蛋白酸完成|,5-161,P1-2A被3C蛋白落催化加工成VP0、VP3和VP1,这3种蛋白相互联系并能够自我组装成二十面体的核衣壳，在病毒粒子最后形成阶段VP0经成熟裂解为VP2和VP4,病毒RNA组装进入75S的空衣壳形成完整的病毒粒子叱潘丽等构建了o型口蹄疫病毒China99株结构蛋白P1-2A、非结构蛋白3C以及部分2B基因(P1-2X3C)的植物双元表达载体pBin438/Pl-2X3C,通过农杆曲.介导法转化番茄，经过ELISA和Westernblot检测表明转基因植株中表达的目的嵌白具有抗原性。转化植株叶片蛋白粗提液经肌肉注射免疫豚鼠，于

11、第3次免疫后28d用100ID如0.2ml的同源强毒攻击，结果表明口蹄疫病毒P1-2X3C基因的转基因番茄表达产物具有良好的抗原性，豚鼠经3次免疫后血清效价可达1:64-1:128,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达60%和100%°Chen等回在番茄中成功表达了VP1蛋白，在给VP1加了内质网滞留信号序列后，使得蛋白在番茄鲜果实中的表达量增加到27Rg/g,随后用表达VP1蛋白的番茄果实喂养小鼠，小鼠产生了EV71特异性的抗血清和免疫球蛋白，并且发现小鼠的抗血清明显抑制了EV71病毒对横纹肌肉瘤细胞的感染。2.3霍乱毒素B亚单位转基因番茄口服疫苗霍乱弧菌(Vibriocholerae)

12、分泌的花乱毒素(choleratoxin,CT)可引起动物和人类重度脱水性腹泻。CT由A亚单位(CPA)和5个B亚单位(CT-B)组成，其中CT-B可以与靶细胞表面的神经节音脂(GM1)受体结合,CT-A则决定毒素的性质。CT-B的五聚物能在不同物种的植物中生产。很乱弧菌的毒索共调菌毛(toxinco-regu】atedpilus,Thp)是其主要黏附素之一，也是一种保护性抗原。辅助定居因子(accessorycolonizationfactor,acf)基因籁包括B、C、A、D四个基因，编码的四种世白与Tcp和CT的形成以及霍乱孤曲的黏附定植相关彭志强等'2。】以Ca35S为启动子，

13、构建了表达CT-B基因的载体，转入番茄，获得了转基因番茄植株，且转基因植株能够有效表达CT-B多肽，多肽表达量占番茄叶片可溶性蛋白的0.055%。之后，这一研究小组又利用番茄果实特异性启动子E8启动子，将CT-B转入番茄植株，并使其在果实中特异表达，然后对试验小鼠进行口服免疫，研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明，CT-B基因在14株番茄植株基因组中被整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达，最高表达辰分别为455和385ngg1FW(鲜重)，口服免疫后的小鼠血液和肠道黏膜中均检测到抗CT-B抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(CT-B)的植物口服疫苗候选植株

14、囚Jiang等同也利用E8启动子驰动CT-B基因，转化番茄，在转基因番茄植株果实中，CT-B最高含鱼占可溶性总蛋白的0.081%,将转基因精茄喂养小鼠后，其血清中也产生了CT-B亚单位特异性抗体，并发现植物纤维对产生的蛋白在消化过程中具有保护作用。Sharma等泌】成功将霍乱病毒辅助定居因rA亚单位(acf-A)与霞乱毒素B亚单位(CT-B)在番茄中融合表达，转基因植株中融合蛋白占果实可溶蛋白的0.25%,占植株可溶蛋白的0.08%o这种融合蛋白在番茄中的成功表达，有望产生更多有潜能的重组抗体。2.4其他转基因番茄口服疫苗除以上几种疫苗外，番茄还是呼吸道合胞病毒、狂犬病、艾滋病、糖尿病等疫苗研

15、制过程中的反应器。Sandhu等在果实特异性E8启动子的控制下，成功实现了呼吸系统病毒RSV的F蛋白在转基因番茄中的表达。1995年,McGarvey等首次在番茄中表达了狂犬病病毒G蛋白，该蛋白在CaMV35S启动子的驱动卜，在番茄叶子及果实中都得到了表达，所表达的蛋白相对分子质量为60和62kD,比在BHK细胞(babyhamsterkidneycell)中表达的66kD略小，主要定位于高尔基体、小囊泡、质膜和细胞壁上，小鼠口服免疫后能诱发特异性保护性免疫应答。陈溪和林忠平心】利用转基因番茄生产人胰岛素，以口服方式摄入胰岛素来研究抑制自以免疫攻击以及预防I型糖尿病中所起到的作用，己经取得了很

16、大的进展。周晓红等获得了能够表达弓形虫多表位抗原基因(toxoplasmagondiimultiepitopeantigenicgene,T-gMAG)的转基因番茄苗，其中两株阳性转基因番茄的果实中所表达的重组蛋白能与抗弓形虫速殖子主要表面抗原1(SAG1)单克隆抗体K7H3发生强免疫反应°Youm等I25】将人p淀粉样蛋白(pamyloidprotein,P-A)基因串联重复序列转入番茄基因组，获得了表达0-A抗体叩抗阿尔茨海默病的转基因番茄植株。3番茄口服疫苗面临的问题及解决方法番茄作为可食用植物应用于转基因植物疫苗的生产，己成功表达了多种外源蛋白，在动物实验方面取得了重要进展。

17、但目前尚有许多问题有待解决。利用转基因植物生产疫苗存在两个缺点：蛋白表达量低；口服时少量被消化。研究人员针对第一种情况，考虑使用强启动子、前导序列和增强子，优化选择的密码子，mRNA去稳定序列的去除，整合非依赖性的衣达，通过协同表达二硫键异构的或伴侣蛋白促进蛋白质的正确表达，通过修饰抗原蛋白基因序列将其定靶于胞内部分，如叶绿体"I、质体【2刀等来提高表达水平：针对第二种情况，采取在抗原基因附近加上一些修饰基因或吸附基因序列（如菌毛蛋白基因），保护口服疫苗不圾被退速消化，使之长时间地停留在消化系统内“另外，转基因食品的安全性也是一个重要的问题，在转基因设计和操作时，要切实从提高安全性和

18、提高表达效率的角度出发，例如使用非抗生素类筛选标记、开展叶绿体转基因、实行多基因同时转化，乃至后加工过程技术采用等，使潜在的危险性降到最低。4应用前景番茄作为可食用植物应用于转基因植物疫苗的生产，展示出了良好的应用前景。要想实现植物可食用疫苗的商业化，下游的疫苗制备工艺和临床免疫实验是不容忽视的。转基因番茄除了供人类食用外，还将成为大量生产目的产品的生物反应平台。例如在次生代谢物、肿痛疫苗的生产、预防性疫苗的生产、人畜共患病的预防和治疗以及动物激素代谢的研究方面都有着广阔的应用前景。Mor等凶将乙酰胆碱怖协基因转入番茄，获得了能产生这种乙酰胆碱酯醵的转基因番茄。乙酰胆碱酯酶姑对有机磷中毒进行解

19、毒的重要药品，是一种医用价值很高的药用蛋白，从转基因番茄中提取的乙酰胆碱酯前活性高、稳定性强，和人体来源的酶具有基本相同的生理学特征。基于口服耐受性以及其他方面的原因，目前转基因植物疫苗投入临床实验的种类并不是很多3）,而转基因番茄口服疫笛投入临床研究的事例目前为止未见报道。在加速转基因植物疫苗产业化的过程中，我们必须对其安全性给予足够的重视，在转基因番茄的研究中，Zhou等"J利用一种不同的转基因方法转质体基因组的研究表明，通过转基因质体方法表达的HIV抗原，有作为艾滋病疫苗成分的潜力。HIV病毒抗原p24和Nef可以在烟草以及番茄的质体中高水平的表达，p24-Nef融合基因表达盒

20、能激发抗原果白的表达，表达鱼累积约占整个植株总蛋白的40%,证明了转质体基因组途径有町能成为生产艾滋病疫苗的低投入高产出的方法，姑分子农业发展的新方向。质体中的细胞器可以高水平的积累外源蛋白，并H由于母系遗传的关系，可以保证生物研究的安全性。虽然安全性问题仍旧没有彻底解决，但也不能因此减缓转基因技术的发展，甚至忽视或否定转基因产品带给人类的益处。相信只要措施得当，转基因番茄疫苗必将造福于人类。参考文献|1SukminK.LiuJR,lakashiY,eta!.Expressionoftheprotectiveantigen(SpaA)intransgenichairyrootsoftobacc

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