常用技术经典案例ci研究

1、技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）目录【文献精讲】circRNAs 功能机制研究2【文献精讲】circRNA 功能新视角：复合体5【文献精讲】外泌体中的 circular RNAs，精准医疗的大门已为你打开9生物1 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）【文献精讲】circRNAs 功能机制研究circRNA 是一类具有调控表达潜能的非编码环状闭合 RNA。随着 NGS 的发展及生物信息分析的进步，现在已经发现在动物细胞中，存在着成千上万的 circRNAs。而对其功能的研究发现也表明，circ

2、RNA 可以作为 microRNA 的海绵吸附体而影响下游的表达，是一种典型的 ceRNA 作用机制。另外， 由于 circRNA 与其相同来源靶的线性 mRNA 的序列高度相似性，可通过 cis 调控其因的表达。来自中国科学技术大学的研究通过对 circRNAs新思路。作用机制的研究为我们提供了 circRNA 研究的circRNAs 筛选已有研究表明 ncRNAs 可以参与转录调控。因此，为了直接找到相关的 circRNA，用 CLIP 实验，筛选了能特异性地与 RNA 聚合酶（Pol）结合的 ncRNAs。研究在 HeLa 细胞中将 Pol CLIP 样本进行 RNA，共鉴定到 111

3、个高通量二代circRNAs ， 同时也发现大部分的 circRNA 表达丰度比较低。对 15 个表达高的circRNAs 进行了 RNAIP 和 RT-PCR 验证，发现一些 circRNAs（circCLTC），特异性地在 HeLa 和和 circPAIP2 子间的内含containing ci核中，表明HEK293 cells 细胞中表达。另外，研究也对其中的两个，circEIF3J-PCR 验证，表明在这些 circRNAs 中，外显生物特异性保留内含子的环状 RNA 为 intron-验表明 circEIF3J 和 circPAIP2于细胞控的转录过程。circRNA 表达与功能分析

4、1 EIciRNAs 可以带着侧翼序列过表达2 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）之前的研究表明 circRNAs 的外显子侧翼序列包含有 Alu 原件，侧翼序列由于序列的重复而成环。对 15 个验证的 circRNAs 序列进行分析发现其中有 4 个是包含有侧翼Alu 原件，另外 4 个不只包含侧翼 Alu 原件。研究将不包含和包含侧翼序列，包含1-kb 互补重复序列的 circEIF3J 和 circPAIP2 构建载体转染细胞，发现包含侧翼序列的circEIF3J 和 circPAIP2在 HeLa 和 HEK293 细胞中表达明显

5、增加。该研究表明，包含有侧翼序列的 circRNA 是可以进行过表达构建的。该构建有便于对 circRNA 进行功能研究。2 EIciRNAs 通过 cis 模式调控表达为了研究 EIciRNAs 的调控功能，研究首先对 circEIF3J 和 circPAIP2 进行了敲降实验（siRNA or ASOs）。RT-PCR 检测发现因的 mRNA 表达明显降低，而对EIF3J 和 PAIP2附近的其他表达没有明显影响。为了确认因转录的影响，将敲降后的细胞进行 run-on 实验，表明 EIF3J 和 PAIP2 的转录水平确实降低。但当将EIF3J 和 PAIP2 的 mRNA 进行敲降后进行

6、 run-on 实验，EIF3J 和 PAIP2 的转录水平没有显著性影响，circEIF3J 和 circPAIP2 的表达水平也没有收到影响。用前面实验的载体进行过表达后发现，EIF3J 和 PAIP2 的 mRNA 表达水平没有明显变化。RNA-DNA 双FISH 实验表明 circEIF3J 和 circPAIP2 除了在因区域出现外，在整个细胞一半以上区域达。3 EIciRNAs为了找了 Pol外，circPAIP2 可能通过 cis 模式调控的表生物启动子结合，研究进行了 pulldown 实验，发现除NA(snRNA)与 circEIF3J 和 circPAIP2 结合。进一步的

7、染色质结合实验（ChIRP）表明 EIciRNA 可以结合到其 因的启动子区域。ChIP 实验表明 U1 snRNP 可以结合到 EIF3J 和 PAIP2 的启动子区域。该结果表明，circEIF3J 和 circPAIP2 可能通过与 U1 snRNP 和 Pol形成复合体，结合到其因的启动子区域调控其表达。4 U1 snRNP 是 EIciRNAs 行使 cis 调控必需的为了确认 U1 snRNP 是否调控了 EIciRNAs 的功能，研究用 U1 阻塞剂（AMO）消除 U1 snRNP 表达，发现可以抵消因为 EIciRNA 敲降而引起的对因表达的影响。同时，run-on 实验表明，

8、U1 AMO 处理可以减少 EIF3J 和 PAIP2 的转录水平。另外，U1 AMO 处理也减弱了 Pol和 EIciRNAs 的结合效率。EIciRNAs 和因启动子区的结合也降低。当敲除 EIciRNAs 后，Pol与 U1 snRNP 蛋白与其因启动子的结合也减弱。FISH 实验验证了 EIciRNA 和 U1 snRNA 在细胞核中与表明 U1 snRNP 是 EIciRNAs 行使 cis 调控必需的。5 U1 snRNA-EIciRNAs 的结合对功能行使非常重要因的共。该结果既然 U1 snRNA 能和 EIciRNAs 结合行使功能，那么，U1 snRNA 结合的位点在哪？通

9、过序列分析发现，在 EIciRNAs 的 5端保留的内含子区域含有一个 U1 snRNA 结合位点。研究用 AMO 阻断该位点后发现 U1 snRNA 和 EIciRNAs 的结合能力降低。同3 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）时，Pol CLIP 实验也验证了 AMO 阻断后 Pol和 EIciRNAs 的结合也降低，run-on表明因的转录水平也相应的下降。ChIP 和 ChIRP 实验分别表明，用 AMO 进行阻断后，U1 snRNP 和 EIciRNA 与因启动子的结合能力也降低。该结果表明这种特异的 U1 snRNA 和 EI

10、ciRNA 结合对于 EIciRNA 转录调控的获得是非常必要的。最后，依据以上实验的结果，研究绘制了一种名为 EIciRNAs 的环状 RNA 调控表达的作用模式图，为我们理解 circRNA 的调控机制提供了强的参考。生物小结circRN但是，作为机制，使得对环状 RNA 的研究起步比较晚。，circRNA 是目前以致未来几年内转以看到，由于环状 RNA 特有的环录组研究领域中热点中的热点。从现有的形结构以及表达丰度低、功能作用方式未知等，目前可循或可参考的资料非常非常少。该文献从前期筛选，结构分析，下游及调控模式探究等方面提供了方法学和思路的详尽描述，为我们想赶在第一波就进入该研究领域的

11、科研提供了参考。原文出处：Li Z, Huang C, Bao C,. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.Nat Struct Mol Biol. 2015,256-64.4 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）【文献精讲】circRNA 功能新视角：复合体circular RNAs 是近年来发现的一类新的具有调控功能的非编码 RNA。circular RNAs 广泛存在于生物发育各个阶段，由于其封闭环状的特性而能稳定存在。现有研究认为 circR

12、NAs 可以通过作为 miRNA 的海绵吸附体调控的表达。circRNAs 是否可以通过其他的形式行使功能呢？今天，小编和大家一起通过一篇在Nucleic AcidsResearch上的研究来了解下 circRNAs 通过和蛋白形成复合体影响细胞周期的生物学功能。研究背景Foxo3 是一个参与发展过程的，通过增强 Akt 的活性或者抑制 PTEN 的活性而抑制肿瘤发展。已有研究表明，上调 Foxo3 会影响细胞周期过程而减少细胞衰老。circular Foxo3（circ-Foxo3）和线性 Foxo3 都来源于 Foxo3。既然 Foxo3 影响了细胞周期过程，circ-Foxo3 是否也参

13、与其中呢？本研究通过一系列的实验证明， circ-Foxo3 可以和p21 与 CDK2 形成三元复合体，抑制了细胞周期过程。研究结果1 circ-Foxo3人和小circ-Foxo3（ 非肿瘤细胞可能也参与生物研究，研究检测了小鼠肿瘤细胞系中源性）和 Foxo3 的表达，发现肿瘤细胞系和呈负相关性。因此 该结果暗示 circ-Foxo3胞系培养和细胞周期分布与 circ-Foxo3 表达检测表明，circ-Foxo3 表达水平在细胞周期抑制时显著增加。在用细胞增殖因子表皮生长因子（ EGF） 处理后 circ-Foxo3 表达水平显著减少， 而在增加 EGF 抑制子AG1478 时会显著增加

14、。因此，circ-Foxo3 的表达和细胞周期与细胞增殖相关。为了确认 circ-Foxo3 在细胞周期过程中的作用，研究用 siRNA 敲降了 circ-Foxo3。细胞增殖 assay 检测表明 circ-Foxo3 siRNA 增加细胞增殖能力。细胞周期分析显示大部分的 circ-Foxo3 siRNA 细胞处于 S 和 G2 期。因此，敲降 circ-Foxo3 siRNA 提高了细胞周期过程。此外， 研究检测了 circ-Foxo3 转染细胞系的细胞增殖能力。结果显示，circ-Foxo3转染细胞系 NIH3T3 的增殖速度变慢。细胞周期分析显示期。小结的转染细胞停滞在 G1 时以上

15、做了一系列的细胞表型实验，无论是 siRNA 还是过表达转染，最后想说明的问题是，circ-Foxo3 的表达异常影响了细胞周期和细胞的增殖能力。2 circRNA 互作蛋白分析找到了生物学表型，接下来的问题是内在的作用机制是什么？5 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）本研究的思路比较特殊，研究想看看是否有和 circ-Foxo3 结合的相关细胞周期蛋白。IP 实验表明，circ-Foxo3 可以特异性拉下 CDK2，CDK6，p16，p21 和 p27。反向 IP 实验表明这些蛋白也能在转染细胞中拉下的 circ-Foxo3。其中，CD

16、K2 和p21 的作用更为显著，CDK2 和 p21 在主要在 G1 时期的细胞中能拉出 circ-Foxo3。因此，研究猜测 CDK2 和 p21 参与了 circ-Foxo3 调控细胞周期过程。生物为了验证这三者之间的互作关系，研究又做了进一步的验证实验。首先，Western blot 分析表明在 circ-Foxo3 转染的细胞中，CDK2 能结合的 p21，对照细胞中结合的 cyclin A 和 cyclin E。同时，转染细胞中，cyclin A 和cyclin E 也是拉下更少的 CDK2。另外，研究也试着将其他的（circ-Amotl1 和 Foxo3）转染测试 CDK2 和 p

17、21 的结合能力，结果显示 p21 可以特异性的在 circ-Foxo3 转染细胞系中拉下 CDK2，CDK2 也是特异性的在 circ-Foxo3 转染细胞系中拉下p21。由于 circ-Foxo3 是特异性的存在于 G1 时期，因此，研究在 G1 时期的细胞也进行了检测。结果显示，G1 时期 p21 可以拉下的 CDK2。同样，在 G1 时期，CDK2 可以拉下的 p21。以上的实验来回进行两两作用验证，最终的结论指向一个，circ-Foxo3，CDK2 和p21 很有可能形成了三元复合体。为了验证该假设，研究又进行了一系列实验。结果显示，在 circ-Foxo3 转染细胞中，p21 形成

18、略大于 CDK2 和 p21 大小相加的蛋白，而6 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）在对照细胞系中，主要是 p21 的单体蛋白。CDK2 的实验也同样验证了在转染细胞中，会形成集合 p21 的 dimer。小结:以上进行了一系列实验说明了一个问题，circ-Foxo3 可以和 CDK2 和 p21 形成三元复合体。3 复合体功能验证既然 circ-Foxo3 和 CDK2，p21 形成复合体。那么，破坏该复合体会引起什么变化呢？研究首先在 siRNA circ-Foxo3 细胞中 IP 检测 CDK2 和 p21，结果显示和 p21结合

19、的 CDK2 减少了，和 CDK2 结合的 p21 也减少了。生检测表明，siR物NA 细胞系中 p21 和 CDK2同样，主要以单体存在。当把 p21 和 CDK2 敲除后，p21 和 CDK2 探针拉下的 circ-Foxo3 也变少。因此，破坏复合体中任何一个，直接影响整个复合体的形成。另外，为了验证 circ-Foxo3 特异性结合 CDK2 和 p21，研究用 circ-Foxo3 用来Northern blot 的探针 pull down p21 和 CDK2。结果显示，circ-Foxo3 转染细胞系能拉下来，而 siRNA 细胞系拉下很少。在 p21 siRNA 细胞系只能拉下

20、 CDK2，CDK2 siRNA只能拉下p21，表明在细胞中存在着 circ-Foxo2-CDK2 和 circ-Foxo2-p21 复合体。7 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）为了进一步验证复合体的稳定性，研究用 RNAse A 处理了 circ-Foxo3 转染细胞和对照。发现转染细胞中还是能检测到 CDK2 和 p21。因此，circ-Foxo3 能保护CDK2 和 p21 而维持三元复合体的稳定。生物小结该部分还起到保护21 形成的三元复合体彼此依赖，circ-Foxo3小编点评该研究是一篇典型的作用机制探究。该研究通过正反向，

21、敲除过表达，不同细胞系等实验，反复验证了 circ-Foxo3 能与 CDK2 和 p21 形成复合体，影响细胞周期和增殖过程。为我们拓宽 circRNA 的生物学功能提供了新的见解，非常值得大家参考。原文出处:Du WW, Yang WN, Liu E, et al. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2. Nucleic Acids Research. 2016.8 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 15

22、1 号（201203）【文献精讲】外泌体中的circular RNAs，精准医疗的大门已为你打开Circular RNAs(circRNAs)是近年来发现的，最新的一类可能具有广泛调控功能的非编码 RNA。由于其封闭成环的特性，我们很容易就联想到，circRNAs 是否可以作为临床诊断的 biomarker 呢？今天，小编通过一篇在cell research上的文献告诉您，circRNAs 作为诊断的 biomarker 是可行的。研究背景circRNAs 是一类广泛存在的内源性非编码 RNA，近年来的研究表明其可以调控哺乳动物的表达。在不同的细胞类型和发育阶段，circRNAs 都稳定存在。

23、由于其结构的特点和潜在的调控功能，circRNAs 是这两年，乃至未来几年 RNA 领域研究的热点。外泌体是细胞的一类小膜囊泡。外泌体中包含了很多特异性的蛋白，mRNA和 miRNA，可调控外泌体接收细胞的功能行使，是理想的疾病诊断 biomarker 候选。那么，外泌体中有 circRNAs 存在么？血来源外泌体中能检测到稳定存在的 circRNAs么？外泌体中的 circRNAs 可作为疾病诊断的 biomarkers 么？该文章的我们一一解答了这些问题。研究结果向1 外泌体中有研究circRNAs 的circRNAs 表qPCR 验证生物M3 和该细胞系中提取的外泌体进行了6751 个

24、circRNAs。同时，外泌体中的表达丰度高是能否进行检测的首要条件）。能验证出来。此外，exo-circRNA 与细胞中circRNA 的相关性也不是很明显（r=0.43），暗示着外泌体中的 circRNAs 可能是被精确调控的。9 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）为了进一进行了 RNA 细胞中 circR 相比线性 m中的普遍性的表达丰度，研究用 RNase R-treats 样本生物circRNA 相对于其线性 RNA 的表达丰度是丰度的 6 倍以上，表明外泌体中的 circRNA了进一步验证 circRNAs 在癌细胞系外泌体，

25、胃癌，和癌细胞系来源外泌体进行了 qRT-PCR 验证，充分说明了外泌体中 circRNAs 的广泛存在性。由于circRNA 可以结合 miRNA，而外泌体中有广泛存在着 miRNAs。因此，研究在外泌体中分析了 circRNA 和 miRNA 的表达关系。结果显示，miR-7 mimics 细胞系外泌体中 CDR1as 表达显著降低。该结果表明，外泌体中的 circRNAs 表达可能受到来自miRNA 的表达影响。10 / 12技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）因此，第一部分的结果解答了一个重要的问题：外泌体中存在着特异性稳定的circRNAs。2 血清外泌体中很检测到 circRNAs 么？用于临床诊断检测最理想的检测材料是血来源样本，那么，血清中的外泌体是否也能检测到 circRNAs 呢？（血液检测是无创诊断的理想方式）通过对 3 个健康血清分离外泌体，RNA-seq 检测 exo-circRNAs，鉴定到 1215 个 circRNAs。数据的对显示，有 90% circRNAs