研究生分子生物学思考题及答案

1、第一次：思考题1. 衰老细胞的特征。衰老细胞的生物学特征。答（1）细胞阻滞于G1期，无法进入S期。（2）不可逆丧失对有丝分裂原的反应能力。（3）调控细胞生长的关键基因的表达发生变化， 正向转录因子抑制，负向调控因子过量表达。（4）细胞的功能“脱分化”。（5）发生凋亡的能力下降。衰老细胞的形态学特征。答 (1) 细胞核增大，核内出现包含物，核膜内陷，染色质凝聚。（2）细胞质内色素积累。（3）线粒体数目减少，体积增大。（4）Golgi体囊泡肿胀，并出现扁平囊泡断裂崩解，分泌及运输功能衰退。内质网排列无序，膜腔扩大甚至崩解，膜上核糖体数量减少。（5）细胞膜流动性减低，干扰了膜蛋白的正常结构与功能。2

2、. 端粒与端粒酶。端粒(telomere)：由几百个简单无信息的重复序列构成的3端凸出的特殊结构。功能：1.保护染色体末端。 2.防止染色体复制时末端丢失，导致染色体断端融合。 3.固定染色体的位置。端粒DNA附着于核基质。端粒酶(telomerase)：一个自带引物的逆转录酶，由酶蛋白和RNA组成，含有1个159nt的RNA部件，该部件含有与端粒d(TTGGGG)重复序列互补的(AACCCCAAC)序列。3. 错配修复(MMR)基因：属于管家基因，可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中未配对的碱基，保证复制和重组的精确性。第二次：思考题1.乳糖操纵子:含有三个结构基因，半乳糖苷酶：催化乳糖

3、分解为葡萄糖和半乳糖； 半乳糖苷透过酶：促进乳糖转运入细菌；硫代半乳糖苷转乙酰基酶，三个基因的上游 只有一个共同的启动子Piac。此外，在启动子的下游和上游还分别有操纵序列Oiac和CAP结合位点，这三者共同构成了乳糖操纵子的调控区，这一区域是控制结构基因是否 转录的开关。 在乳糖操纵子的上游还有一个调节基因I，其编码产物是lac阻遏蛋白，在没有诱导剂的情况下，阻遏蛋白可与操纵序列特异结合并阻止结构基因的转录。 乳糖操纵子的转录起始是由CAP和阻遏蛋白两种调控因子来控制。CAP起正调控作用。2. 真核基因组的特点（找不到）2.真核基因表达调控的特点：答：、DNA量大。、真核细胞的编码基因大多是

4、不连续的，有外显子和内含子镶嵌排列而成；、真核生物DNA中含有大量的重复序列；分为低度、中度和高度。、不存在操纵子结构。3. 真核基因转录前表达调控的方式答：是发生在基因组水平上的基因结构的改变。包括： 基因丢失：体细胞分化过程中，必须将某些基因永久性关闭。最简单有效的方式将这些基因丢失。 基因扩增：发育分化、环境条件的改变，对某些基因产物的需要量急剧增加增加该基因的拷贝数。不适当的基因扩增，可导致肿瘤的发生 基因重排：某些基因片段改变原来存在的顺序重新排列组合。 甲基化修饰：DNA甲基化可引起构象、稳定性和染色质结构的改变，并影响DNA与蛋白质的相互作用，抑制基因的转录。抑制取决于甲基化Cp

5、G的密度和启动子的强度，转录活跃的基因是低甲基化或不甲基化，而不表达基因的则高度甲基化。4. 顺式调控元件：与结构基因串联的特定的DNA序列。包括启动子、增强子、沉寂子、加尾信号。1）启动子（Promoter）：与基因转录启动有关的核心序列。包括核心启动子：足以使RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的起始子。 ATA盒的功能：决定了转录的精确起始；介导转录起始复合物的形成；产生基础水平的转录。上游启动子元件（UPE）:含CAAT和GC盒，位于转录起始点-75bp区域。提高转录效率。 2）增强子（enhancer）:有多个独立的具有回收结构的核苷酸组成，以单或多拷贝的形式存在，促使基因转录活性

6、。具有：组织特异性；无基因特异性；无方向性；远距离作用；相位性。3）沉寂子：抑制基因转录。4）加尾信号：polyA尾位点上游1020bp常见保守序列AATAA,去除此序列，基因会连续转录下去。5. RNA“编辑:是RNA分子上的一种修饰，通过核苷酸插入、缺失、替换，使信息改变，产生氨基酸序列不同的多种蛋白质，以扩大遗传信息，提高生物适应。6. 反式作用因子的结构：一个完整的反式作用因子含有2个必不可少的结构域，即DNA结合结构域和转录活化结构域，反式作用因子通过前者与DNA特定序列结合，通过后者发挥转录活化功能。DNA结合结构域：含有辛指结构域同源盒结构域亮氨酸拉链碱性螺旋袢螺旋。转录活化结构

7、域：含有酸性-螺旋结构域富含谷氨酰胺结构域富含脯氨酸结构域第三次：思考题一、 名词1.蛋白：一般是指与膜受体偶联的异三聚体G蛋白, 由、三种亚基组成 。分子量100kD左右。蛋白在结构上没有跨膜蛋白的特点，它们通过对其亚基上氨基酸残基的脂化修饰作用将G蛋白锚定在细胞膜内侧。其主要类型有Gs、Gi、Gq、Gt等。2.SH2结构域：由约100个氨基酸残基组成，介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合。这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的基序（motif）。3.SH3结构域：由约50100个氨基酸残基组成，介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨

8、基酸残基所构成的基序序列相关。4.JAK：是胞质内的一类非受体酪氨酸蛋白激酶家族，已发现有4个成员，即JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。其结构不含SH2 、SH3，C端具有两个相连的激酶区， N端的几个结构区段无酶活性，可能在受体蛋白与JAK偶联中发挥作用。5.STAT ：又称为信号转导子和转录激活子，具有信号传递和转录因子双重功能。包括STAT1STAT6， STAT的C末端有SH2结构域，而且有一保守的酪氨酸位点，该位点被激活的JAK磷酸化，使STAT活化。二、问答：1.简述G蛋白跨膜传递信息的机制当受体未与配体结合时，G蛋白的三个亚基呈聚合状态，亚基与GDP结合，无活性。 当受体与

9、配体结合时，活化的受体将导致G蛋白亚基释放它原来结合的GDP，代之以GTP，从而使G蛋白激活。活化的G蛋白三聚体解离成G-GTP和G两部分，不再和受体结合。通常由G-GTP（有时由G）结合并激活（或抑制）质膜中的某种酶，这种酶产生第二信使。G具有GTP酶的活性，把它所结合的GTP水解成GDP和Pi，从而使G失活，然后再与G亚基结合生成无活性G·GDP，受体的作用终止。2.试述RPTKRas信号传递途径3.举例说明cAMP信号传递途径以糖代谢为例说明cAMP信号传递途径。激动型激素+激动型G蛋白激活 ATP腺苷酸环化酶 * 表示有活性的酶第四次：思考题名词：1.cyclin box：各

10、类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclin box),它的功能是结合和激活CDK 。 2.R点(restriction point)：G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？问答：1. 简述细胞周期各时相cyclin的种类及作用。cyclin 的种类繁多，分别参与细胞周期中不同时相的调节。分为G1型、G1/S型S型和M型4类。G1期 细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与C

11、DK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。 G1 / S期 cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。 S期 将CyclinA的抗体或反义的cDNA注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的。G2/M期 cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件M期 在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC ，负责将泛素连接在cyclinB上

12、，导致cyclinB被蛋白酶体降解，完成一个细胞周期.2. 简述细胞周期的主要检验点（check point）及功能。 G1/S检验点：控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括： 所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：所有染色体都排列在纺锤体上了吗？任何一个着 丝点没有正确连接到纺锤体上，引起细胞周期中断.3. 试述CDK1不同位点氨基酸残基磷酸化/去磷酸化对其活性的调

13、节。以P34cdc2 (CDK1)为例，如果对P34cdc2(CDK1)磷酸化作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制。完整的P34cdc2(CDK1)-cyclin复合物需要磷酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。P34cdc2(CDK1)的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2(CDK1)-cyclin复合物的失活. P34cdc2(CDK1)的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。第五次：思考题名词1.质粒；质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。分为两类：严紧型质

14、粒：在寄主细胞内的复制除了受本身遗传结构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少。松弛型质粒;复制只受本身的遗传结构的控制，有较多的拷贝数。2.基因文库；某生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，经筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合称。 理想地包含着该物种的全部遗传信息3.Real time-PCR; 即实时荧光定量法PCR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程中每一轮循环产物的累积数量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。提供 PCR 扩增的瞬时信息4.多克隆位点；multip

15、le cloning sites,MCS . 是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。5.限制性内切酶；是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。6.核酸杂交：检测混合样品中特定核酸分子的存在，以及其分子量大小。7.T-A克隆：Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可在 新链的 3' 末端添加一个核苷酸，通常为 A 问答：1 .举例说明两种转基因方法。显微注射法：显微注射时需要持卵管和显微注射针，需预先制备。持卵管用于注射时吸住受精卵，显微注射针用于将DNA注射入受精卵内。即制备持卵管制备显微注射针

16、显微注射移卵Hammer等在1985年应用该方法成功地制作了转基因兔，绵羊和猪，这三项研究被认为是转基因动物研究历程上的里程碑。 体细胞核移植技术：先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。然后，将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的后代个体百分之百是转基因个体。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与俄罗斯研究所的Wilmut等联合，通过体细胞核移植技术，获得了3只转基因绵羊（有1只生后不久死去），它们就是与”Dolly”齐名天下的“Polly”，“Molly”，“Holly”和Olly。体细胞克隆技术用于转基因

17、动物研究堪称为转基因动物研究史上的又一里程碑。2 简述DNA recombination （DNA重组）的连接方法。粘性末端连接：双酶切，定向克隆平末端连接：两个具有平末端的双链DNA分子连接。问题：低效率、串珠现象；人工接头连接法：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造粘性末端，再进行连接的方法。 同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),制成人工粘性末端； 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA分子

18、。3 试述Southern blot 原理及应用。 Southern blotting ：用合适的限制性内切酶将DNA切割后, 进行电泳分离后, 利用干燥的吸水纸产生毛细作用, 使液体经过凝胶, 从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交。作用：检测特定基因的大小、拷贝数、变异等。流程:.1.总 DNA的抽提、质量检测；.2.限制性内切酶操作；.3.DNA的琼脂糖凝胶电泳、0.4N NaOH碱变性；.4.转膜（毛细管渗吸或电转移）；.5.80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜；.6.探针的制备、同位素操作等。.7.预杂交,杂交,放射自显影.第六次：思考题问

19、答：1 简述癌基因及其激活机制。癌基因: 是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。癌基因异常表达时，其产物可使细胞无限制分裂癌基因包括病毒癌基因(v-onc)和细胞癌基因(cellular oncogene，c-onc)原癌基因激活机制：(1)点突变，(2)获得外源启动子，增强子，转录增强，表达活性增强。(3)原癌基因甲基化程度降低。(4)原癌基因重排。(5)染色体易位。2. 简述基因诊断中常用的分子生物学技术（1）、核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补大量的DNA/DNA,RNA/RNA互补配对成双链杂交分子。原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序

20、在其原位进行杂交，可用于DNA,RNA的定位研究。（2）、聚合酶链反应：又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增的(DNA)模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。（3）、单链构象多态性分析：把PCR后获得的双链DNA加热变性后形成单链DNA，相同长度的DNA单链由于碱基顺序不同，它们在中性聚丙稀酰胺凝胶中可有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种现象称为单链构象多态性。（4）、限制酶酶谱分析：基因突变致酶切位点的丢失或相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA,通过比较二者的酶切片断的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（5）、D

21、NA序列测定；分子克隆到载体上，或直接对扩增产物进行测序。（6）、DNA芯片技术：将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。3. 简述基因治疗的主要策略(一)基因标记 解决：（1）外源基因能否安全的转移到患者体内。（2）患者体细胞中能否检测到转移基因的存在。（二）基因置换（基因矫正） 特定的目的基因转入特定的细胞，通过定位重组或同源重组进行基因矫正。（三）基因添加 导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的产物。（1）导入正常基因补偿缺陷基因的功能。（2）导入新基因，利用其表达的产物治疗。（四）基因干预 采用特定方法抑制某个基因的表达或破坏某个基因使其

22、不表达， 已达到治疗的目的。 方法：(1) 反义RNA (2) RNA干扰 （3）三链DNA (4)核酶名词解释：1.基因诊断（gene diagnosis）：采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因结构（DNA水平）或功能（RNA）水平是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断，是病因诊断。2.单链构象多态性（SSCP）：把PCR后获得的双链DNA加热变性后形成单链DNA，相同长度的DNA单链由于碱基顺序不同，它们在中性聚丙稀酰胺凝胶中可有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种现象称为单链构象多态性。3.聚合酶链反应（PCR）：利用人工合成的一对引物，在被扩增的(DNA)模板链的两端形成双

23、链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。4.基因干预：采用特定方法抑制某个基因的表达或破坏某个基因使其不表达以达到治疗疾病的目的。5.DNA指纹：针对重复序列人工合成寡核苷酸片断作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行southren blot杂交，可以得到大小不等的杂交带而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就象人的指纹一样，以因而把这种杂交带图谱称。6.RNA干扰：RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，短双链RNA（dsRNA）引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。第七次：思考题1. 蛋白质组及蛋白质组学概念蛋白质组：是蛋白质和基因

24、组两个词的组合词，即基因组表达的全套蛋白质，蛋白质组是一个动态的概念。蛋白质组学（Protemics）：则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。2. 比较蛋白质组学（表达）的技术平台及实验流程答：技术平台 双向凝胶电泳技术（2-DE）原理：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳(IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。质谱技术原理：基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）两种“软电离” 技术的出现使得质谱技术得到迅速的发展，成为蛋白质鉴定的核心技术。所

25、谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。双向电泳与质谱技术的联合应用成为蛋白质组学研究的基本技术平台。生物信息学：在蛋白质组学研究中有两个重要应用：一是分析和构建双向凝胶电泳图谱，二是搜索与构建蛋白质组数据库。生物信息学由数据库和工具软件组成。蛋白质组学研究的基本流程蛋白样品的制备及定量总蛋白的双向凝胶电泳凝胶分析软件分析蛋白点获取及胶内酶解（胰肽酶）质谱分析（肽质量指纹图谱）数据库搜索鉴定蛋白性质。3.几种功能蛋白质组学研究方法的基本原理答：（1）、蛋白质芯片:是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。（2）、噬菌体展示技术：以经过改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因P区或P区，