第3章 DNA复制

1、 3.1. 基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) 第第3章章 DNA复制复制 (DNA Replication) 3.1. 基本概念基本概念3.2. 复制起点与方向复制起点与方向 3.3. Semi-Conservation Replication 3.4. 复制的方式复制的方式 3.5. 线状线状 DNA的复制的复制3.6. DNA复制的基因与酶类体系复制的基因与酶类体系 3.7. DNA复制速率及拷贝数的调控复制速率及拷贝数的调控 3.8. Methylation of DNA 遗传物质的分子机制遗传物质的分子机制分子生物学的核心分子生物学的核心Watson &

2、; Crick:Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因的突变基因的突变 控制性状的表达控制性状的表达DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 每单链每单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTP,dNTP, 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分

3、子的过程。分子的过程。 Replicon( Replicon(复制子复制子); ); 基因组中能独立进行复制的单位。基因组中能独立进行复制的单位。 Replisome ( (复制体复制体); ); A unit of the genome in which DNA A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator contain a region from origin to terminator The multi protein (30 The multi protein (30) st

4、ructure that assembles ) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNAat replicating fork to undertake synthesis of DNA DNA replication at phase S of cell cycle DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs5

5、00-5000 bp/min G112hs?3.2. 复制起点与方向复制起点与方向（replication origin & direction ） isolation of ori rich AT & palindrom rich AT & palindrom Enzymes binding site Enzymes binding site 复制起点的特征复制起点的特征复制起点的特征复制起点的特征J. W. Zyskind 克隆到克隆到E.coli oriC确定其最小区段为确定其最小区段为245bp，并，并与沙门氏菌等与沙门氏菌等4钟细菌的钟细菌的oriC序列进行比

6、较分析发现；序列进行比较分析发现； 245bp minimal origin of replication 245bp minimal origin of replication rich AT & DNA polymerase (DnaA) binding site rich AT & DNA polymerase (DnaA) binding site RNA pol 发动发动primer真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的uARS (automatic Replication Sequence) 自主复制序列uARS1 (A, B1,B2,B3) A区具有高度保守性 u

7、B区变化较大AT rich 复制起始区的复制起始区的“呼吸呼吸现象现象” DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条导致两条DNA链不断解链与聚合，链不断解链与聚合， 形成瞬间的单链泡状结构的过程。形成瞬间的单链泡状结构的过程。 在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显 复制的多模式复制的多模式 单单起点、起点、单单方向方向多多起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向1963 Cairns 1963 Cairns 37 , 5 ci / mM H3-T , 6min 37 , 52 ci / mM H3-T ,

8、6min 42 , T, one circle DNA双向复制的证据双向复制的证据 模式？模式？E. coli mut.ts 复制发动温度敏感突变型复制发动温度敏感突变型42不能发动不能发动DNA复制、但可完成复制、但可完成DNA延伸延伸模式 ？单单 起起 点、点、双双 方方 向向两个复制叉 子链子链DNA延伸方向延伸方向 DNA polymeraseDNA polymerase reacts on the 3 reacts on the 3 end only end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5New DNA elo

9、ngation from 5 to 3 to 3 direction direction ppp OH C+ ppi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要，因能量的需要， DNA的的5 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0.2M Nacl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到难以聚

10、合到DNA的的5端，而且端，而且 双链双链DNA的的5端碱基配对困难。端碱基配对困难。碱基发生错配后的校正碱基发生错配后的校正 费时、费能（增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗）费时、费能（增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗） A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 3.3. DNA的半保留复制的半保留复制 （Semi-Conservative Replication） 半保留复制的半保留复制的实验验证实验验证(Meselson and Stahl, 1958)3535OK !How ?5353one strand of DNA repli

11、cation in Okazaki fragment 1kb5353DNA replication in Okazaki fragment 1kb5353（semi-discontinuous replication ! semi-discontinuous replication ! ） ？a)Okazaki fragment a)Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki1968 Reiji Okazaki 半不连续复制半不连续复制 Olivera, 1978 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous r

12、eplication） 证据证据 Okazaki片段的发现，为不连续复制提供片段的发现，为不连续复制提供了有力的证据了有力的证据。 Prok. 1-2kb, Euk. 0.1-0.2kb 在复制叉上发生一条新链为连续合成，在复制叉上发生一条新链为连续合成，另一条链为不连续合成的复制机制。另一条链为不连续合成的复制机制。leading strand lagging strand leading strand（前导链） ：连续复制：连续复制lagging strand（后随链）：按后随链）：按Okazaki 片段不片段不连续复制连续复制3.4. DNA复制的模式复制的模式 (DNA replica

13、tion model)(DNA replication model) 新起始方式新起始方式 （de novode novo initiation initiation） 或复制叉式或复制叉式（replication forkreplication fork） 环状环状DNADNA复制复制 （ form form ，5050，000bp/min)000bp/min)多复制子多复制子 真核生物（真核生物（1000-3000bp/min) 1000-3000bp/min) 大多数生物染色体采取大多数生物染色体采取双向对称复制双向对称复制。枯草杆菌采取不对称复制。枯草杆菌采取不对称复制。startin

14、g pointstarting point RNA primer RNA primer transcriptional activation transcriptional activation leading strand leading strand fork fork lagging strand lagging strand DNA聚合酶不能发动子链聚合酶不能发动子链DNA的复制起始的复制起始. DNADNA聚合酶行使聚合作用需要：聚合酶行使聚合作用需要：以四种以四种dNTPdNTP作为底物作为底物模板指导模板指导延伸方向延伸方向5 533引物提供引物提供3 3-OH-OH RNARN

15、A引物的合成（引物的合成（ATPATP，GTPGTP，CTPCTP，UTPUTP） RNARNA聚合酶聚合酶和和引物合成酶引物合成酶(primase)(primase) 引物的长度：几个引物的长度：几个1010个核苷酸个核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶I I：RNARNA引物的消除和缺口的填补引物的消除和缺口的填补 DNA DNA复制过程中的复制过程中的RNA primerRNA primer DNA聚合酶不能发动聚合酶不能发动子链子链DNA的复制起始的复制起始 !E.coliRif s Rif S + M13E.coliE.coli Rif R M13+ S.S. DNA virus+RF无

16、M13 RFRifampinM13Rifampin有M13 RF有M13 RF M13 Rifampin Rifampin Rifampin 是是E.coliE.coli RNA polymerase RNA polymerase 的抑制剂的抑制剂 RNA primerRNA primer 的证据：的证据： DNA DNA复制的转录激活复制的转录激活 (transcriptional activation） RNA polymerase Rif RNA polymerase Rif S S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprima

17、se Rif R for lagging Strand Primosome（引物体）（引物体）pppRNA as primerDNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase RNApol (RNA polymerase) Rif RNApol (RNA polymerase) Rif S S dnaG (primase) Rif dnaG (primase) Rif R R 完成对后随链引物的合成完成对后随链引物的合成 完成完成10 Nt RNA引物合成后引物合成后. DNApol 进行进行DNA链的延伸链的延伸 D

18、NApol I 对对RNA引物切除并聚合填补引物切除并聚合填补 连接酶连接酶 (ligase）将）将 Okazaki Okazaki 片段片段.完成对前导链引物的合成完成对前导链引物的合成 实现实现DNA复制的转录激活起始复制的转录激活起始较前导链的启动落后一个较前导链的启动落后一个Okazaki片断片断 Conclusion 5333共价延伸方式共价延伸方式transcriptional activation ? 共价延伸方式共价延伸方式（covalence elongationcovalence elongation） 或或 滚环方式滚环方式 rolling circlerolling c

19、ircle） D.S. DNA Nick leading StrandElongation rolling Lagging Strand非冈崎片段模式非冈崎片段模式 置换式置换式 或或 D-Loop （Displacement formDisplacement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplast DNA also in chloroplast DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop 复制叉两侧复制叉两侧

20、DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋E.coli E.coli C / genome = 4.2 106 bp 30-40m/ 每次复制历时每次复制历时 10 bp / 每圈螺旋每圈螺旋 84000 -105bp / min 解旋解旋 ( 8400-10000 rpm ! 高速离心机高速离心机 )能量？能量？复制叉两侧复制叉两侧DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋DNA topoisomerase I DNA的单链瞬间断裂的单链瞬间断裂 （transient single-strand break） 缓解缓解高速旋转，高速旋转， 引入正向超螺旋，解出引入正向超螺旋，解出overwinding的应力的应力D

21、NA topoisomerase II DNA的双链瞬间断裂的双链瞬间断裂 （transient double-strand break） 缓解缓解高速解旋时，高速解旋时，DNA双链的相互缠绕双链的相互缠绕 产生产生负超负超消除复制叉移动时产生的消除复制叉移动时产生的正超正超DNA Helicase (DNA 解旋酶）解旋酶） ATPase活性，解除活性，解除 1氢键氢键 水解水解2ATPTop I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)DnaB proteinDnaC protein Primas

22、e DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase for primosome复复制制体体进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisomeprimosome （引发体）（引发体） PriA (dual role) displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, act

23、ion with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase(引物酶引物酶) 进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisome 3.5. 线状线状 DNA的复制的复制 及避免及避免5末端短缩的模式末端短缩的模式 （5-end shortend ） 3-OH ? 3-OHLagging strand of Lagging strand of 环状环状 DNA replication DNA replication Lagging strand of L

24、agging strand of 线状线状 DNA replication DNA replication But 3-OH ? Watson J. D Watson J. D T T7 7 phage phage Direct repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offspring DNA after replication ?concatermer concatermer 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHb) 真核生物染色体真核生物染色体 DNA末端补齐模式末端补齐模式 端粒的发现端粒的发现 193

25、8 Muller X-ray Drosophila 末端极少发生缺失和倒位末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定构，使染色体趋于稳定.并定名为并定名为Telomere 1938 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。 推测染色体末端具有特殊端粒结构。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s 分子生物学发展 端粒研究获得突破 2009年生理学年生理学/医学奖医学奖 Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Sz

26、ostak 加利福尼亚加利福尼亚旧金山大学旧金山大学 霍普金斯医学院霍普金斯医学院霍华德休斯霍华德休斯医学研究所医学研究所 for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase 端粒端粒DNA ( (四膜虫四膜虫) ) E. BlackburnE. Blackburn，19841984TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AAC

27、CCC 5 (rich C chain) pBR322PvuBg1ARSTELTELBam H1Bam H1四膜虫四膜虫rDNABg1PvuBam H1转化酵母转化酵母Pvu传代传代酵母酵母TEL？！？！ Elizabeth H. Blackburn 加尾实验加尾实验 转化酵母转化酵母 传代传代酵母酵母TELPvu 酶切连接Pvu酵母酵母 DNAPvu酵母酵母TEL酵母酵母TEL？！？！ 端粒的模板链在何处端粒的模板链在何处?端粒酶的发现为揭示端粒序端粒酶的发现为揭示端粒序列复制的模板及避免列复制的模板及避免5端端短缩的机制奠定了重要的基短缩的机制奠定了重要的基础础 端粒的模板链在何处端粒的模

28、板链在何处?加尾实验未能证明延伸端加尾实验未能证明延伸端粒序列的模板从何而来？粒序列的模板从何而来？ 1987. Carol W. Greider & Elizabeth H. Blackburn 端粒酶的发现及组成端粒酶的发现及组成尖毛虫尖毛虫 telomere binding proteintelomere binding protein 1 55kd telomere binding protein telomere binding protein 2 26 kd四膜虫四膜虫 telomerasetelomerase游扑虫游扑虫 telomerasetelomerase+ 100

29、 bp telomere 200500KDaRNA CAACCCCAA 链链 + 具有具有逆转录酶活性的 末端结合蛋白末端结合蛋白(TBP） 1990 Yu和和Blackburn 在体外加尾实验的反应体系中在体外加尾实验的反应体系中 加入这段加入这段RNA区域的反义序列区域的反义序列GTTTTGGGGTTG证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板 端粒酶的加尾功 能受到明显抑制1990 Yu和Blackburn 在体外加尾实验的反应体系中证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板 转化四膜虫后代的染色体端粒出现了突变序列的端

30、粒对对CAACCCCAA序列进行诱变序列进行诱变 端粒合成 modelmodel TBP is Reverse transcriptase-like RNA complement with 3 end of DNA & as template for cDNA Elongated T2G4 3-end as primer for 5-end DNA synthesis G链链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链链-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 TTGG链链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链链-A2C4-TTG telomer

31、ase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 GGGTTGG链链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链链-A2C4-TTGGGGTTG- telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 G G hoogsteen bond Tetraplex helix G链链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链链-A2C4- G链链 T2G4-

32、TTGGGG t t g g g g t t gC链链-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polor多细胞组织的体细胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一多细胞组织的体细胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代细胞分裂后染色体末端缩短。这种缩短如果到达信息代细胞分裂后染色体末端缩短。这种缩短如果到达信息DNADNA（ informational DNA informational DNA）, , 细胞将逐渐衰老和死亡。细胞将逐渐衰老和死亡。 细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值细胞停止分裂或死亡细胞

33、停止分裂或死亡When telomerase activity is repressed人体发育完成，端粒酶被抑制，人体发育完成，端粒酶被抑制， 细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小 大端粒长度端粒长度 长 短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老癌细胞的繁殖癌细胞的繁殖 ( (端粒酶的激活！细胞

34、得以永生！端粒酶的激活！细胞得以永生！) )研究端粒研究端粒（记时器）（记时器）丢失的速率丢失的速率/ 年，预测人类的寿命年，预测人类的寿命 随着组织、细胞的老化随着组织、细胞的老化染色体端粒的长度变短染色体端粒的长度变短小麦不同细胞内端粒长度的变化The termination of DNA replication E.coli (单起点双方向单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）不是复制叉简单相遇） terE, D, A terF, C, B (22bp保守区保守区)F BTerminus Utilization Substan

35、ce（TUS 36kd）CADETer-TUS复合体 terE, D, A 仅对反时针方向的复制叉具有终止效应仅对反时针方向的复制叉具有终止效应 terF, B, C 仅仅对对顺时针顺时针方向的复制叉具有终止效应方向的复制叉具有终止效应 F BCADETer-TUS复合体复合体 (Rep. fork trap)终止终止DnaB(螺旋酶螺旋酶)防止防止DNA过度复制过度复制避免出现避免出现DNA多聚体，高拷贝多聚体，高拷贝氨基酸饥饿状态，氨基酸饥饿状态，DNA复制起始失控复制起始失控 . DNADNA的复制基因的复制基因 与酶类体系与酶类体系 a) 原核生物的复制基因与酶类原核生物

36、的复制基因与酶类 Initiation genes dna B prepriming 300kd 20 copies/cell hexamerRNApol primase for leading S. dna C acts with dnaB 25kddna G primase for lagging S. 60kd 25 (Okazaki fragment ) monomer SSB Binding with S.S.DNA 74kd 300 Prevents from anneal monomer Elongation genes与酶与酶 dnaE DNA polymerase III()

37、 140kddnaZ DNA polymerase III() 52kdpolA DNA polymerase I 109kdpolB DNA polymerase II 90-120kd解螺旋酶和连接酶解螺旋酶和连接酶 rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNAlig Ligase缺口缺口酶活化酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化缺口腺苷化封口连接封口连接dAMP b) DNA聚合酶聚合酶 （DNA polymerase） 109kd 120kd 250kd monomer klenowklenow fragment + EF-II

38、+ProkaryoteProkaryote I II III 5 3 elongation (dNMP)n + xdNTP (dNMP)n+x + xppi 10 dNt/sec 1/10 of pol I 500dNt/sec (75, 36) KornbergKornberg E Ehetero-multimer multimer 3 5 editing mismatch 10-8 10-3 yes 5 3 exonuclease small fragment repair No No I II III mutation lethal lethal 功能功能 切除引物，修复切除引物，修复

39、修复修复 复制复制大片段具有聚合酶和大片段具有聚合酶和3535的外切核酸的外切核酸酶活性酶活性(Klenow(Klenow酶酶) )小片段具有小片段具有5 35 3的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性DNA polymerase IDNA polymerase I多亚基酶多亚基酶功能：不是复制酶，是修复酶功能：不是复制酶，是修复酶DNA polymerase IIDNA polymerase IIDNA polymerase III DNA polymerase III activable DNA pol III DNA pol III (holo Enzyme)(holo Enzyme) + (

40、dnaE)(dnaE) DNA pol III (core Enzyme)(core Enzyme) + EF-II 730 nt / sec. in vitro1000nt / sec. In vivo + ( dnaZ co-pol III ) +c) c) 真核生物真核生物DNADNA复制的特点及聚合酶复制的特点及聚合酶 multiple replicon Prok. 105 bp/min Euk. 1000-3000 bp/min 5-300kb/复制子复制子 DNApol + primase (50-60kd)DNApol + primase (50-60kd) 6-9 Nt RNA

41、 as primer 例；果蝇例；果蝇 5000 repliconsreplicons受精后受精后genome replication/3min Replicons 扩增到扩增到50,000Euk.Euk.染色体在全部复制完成之前起染色体在全部复制完成之前起点不再从新开始复制。而点不再从新开始复制。而Prok.Prok. 起点起点可以连续发动复制。可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，往往采用真核生物在快速生长时，往往采用更多更多的复制起点。的复制起点。 DNA polymeraseDNA polymerase (主要酶类主要酶类) Maxi. pol Mini. pol Nuclei Nu

42、clei mt 120-300 kd 30-50 kd 150-300kd polymerize 5 3 yes yes editing 3 5 No No RNA primer No No No No DNA primer 2000-6000mole. / cell3.8. DNA 复复 制制 速速 率调率调 控控 Repressor model Antisense RNA model RNA-2 Positive control RNA-2 Positive control 0-555 0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA repli

43、cation e.g. ColEI plasmid (15-20)e.g. ColEI plasmid (15-20)Negative controlRNA-1110 bp RNase H 不能识别不能识别D.S. RNA-1/RNA-2, 不能形成不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 bp D.S. RNARNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rop Rop gene expressiongene expression RNA-1RNA-1 / / RNA-2 D.S. repressionRNA-2 D.S. rep

44、ression RNA-1 / RNA-2 不能形成不能形成primer的的 3-OH 促进促进 限限制制 63 aa ROP63 aa ROP(Rop protein)(Rop protein) RNA-2 只能转录到只能转录到100-220 base, 不能到达不能到达“0”原点原点 不能形成不能形成primer 的的3-OH0 ColEI plasmid (15-20 copies)以负控制为主的调控方式防止过度复制不相容性质粒不相容性质粒具有共同的复制调控机制具有共同的复制调控机制 (相互竞争相互竞争, 相互制约相互制约)相容性质粒相容性质粒( F, ColEI )复制调控机制完全不同复制调控机制完全不同 (和平共处和平共处, 互不干扰互不干扰)3.9. DNA的甲基化（的甲基化（Methylation） (m5C in Eukaryote) mm5 5C C a) DNA中中m5C的特点的特点 对对MspI,