western-blot-教学

1、SDS-PAGE & Western Blot提问：RT-PCR、WB、免疫组化、 FCM、ELISA、Bio-plex 用来 检测什么？ 有何区别？SDS-PAGE 蛋白分析的利器；Western 既可以定性，又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。 Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是检测混合样品中检测混合样品中单一特定蛋白单一特定蛋白的常用技术。的常用技术。灵敏度可以达到灵敏度可以达到1-5pg.

2、1-5pg. 研究检测样品中特异性蛋白质的存在研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究蛋白质分子的相互作用研究 Western Blot 应用应用 蛋白样品制备蛋白样品制备 SDS-PAGE 转膜转膜 抗体检测抗体检测 化学发光成像化学发光成像蛋白样品制备蛋白样品制备1蛋白抽提方法蛋白抽提方法物理方法物理方法反复冻融反复冻融机械搅拌机械搅拌超声超声研磨研磨酶解法酶解法(裂解酶裂解酶)化学方法化学方法自溶法自溶法 去污剂去污剂总蛋白的提取总蛋白的提取材料：HT-29细胞（收集25cm培养瓶一瓶）试剂：RIPA蛋白抽提试剂

3、 （裂解液有多种，根据需要选择）检测 beta-actin，分子量43KDa注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，提前前需加入1x coaktail (含PMSF) ，冰中 操作。 PMSF: 丝氨酸蛋白酶抑制剂【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 PMSF在水中不稳定，故需在使用前再加 PMSF；PMSF低温时会有冰晶，用时要摇匀至无结晶。1、贴壁细胞，去培养基，加入贴壁细胞，去

4、培养基，加入2ml预冷预冷的的PBS，洗洗2-3 次，最后移至次，最后移至EP管中，用滤纸管中，用滤纸弃干水分，弃干水分，25cm培养瓶一瓶加入培养瓶一瓶加入120 L配好的含多种酶抑制剂的配好的含多种酶抑制剂的RIPA裂解液，用枪裂解液，用枪头轻轻将细胞吹头轻轻将细胞吹散散，放在冰上裂解，放在冰上裂解20-30min，期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次以使细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，以使细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，14000转，转，4离心离心15分钟。取上清即得所需总蛋白。分钟。取上清即得所需总

5、蛋白。组织样品：按组织样品：按100 mg组织加组织加1 ml的的RIPA裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。冰中裂解，余同上。冰中裂解，余同上。如果有些样品提时发现如果有些样品提时发现粘度粘度较大（粘是因为含较大（粘是因为含核酸核酸多），可置于冰中进行超声数次；多），可置于冰中进行超声数次；或者加核酸酶以降解核酸。或者加核酸酶以降解核酸。提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），-80保存备用。保存备用。注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于-80，以备

6、用。，以备用。如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂。 在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。 BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。 在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液（蛋白样品与上样缓冲液（5x）按）按4:1的比例混合后，放在的比例混合后，放在100加热器中加热加热器中加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心离心，一周内要做的存至，

7、一周内要做的存至-20，一一个月内要做的放于个月内要做的放于-80 冰箱冰箱。如果蛋白浓度很高的话也可以选择蛋白上样缓冲液（如果蛋白浓度很高的话也可以选择蛋白上样缓冲液（2x）。）。 SDS-PAGE21、应用于提纯过程中纯度的检测、应用于提纯过程中纯度的检测2、用于分子量的检测、用于分子量的检测3、蛋白浓度测定（只跑浓缩胶，用已知浓度、蛋白浓度测定（只跑浓缩胶，用已知浓度BSA对比）对比）SDS-PAGE原理原理SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物链 N,N-亚甲双丙烯酰胺 (B) ：形成纵向架桥（cro

8、ss-linkage）过硫酸铵(APS，Ammonium persulfate) ：助凝剂TEMED(si)：催化剂 O CH2=CHCNH2 O O CH2=CHCNHCH2NHCCH=CH2 CONH2 CONH2 CONH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH CONH CH2 CONH CONH2 CONH2 CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH CONH APS, TEMED( (神经神经毒性毒性) )1、30%丙烯酰胺储备胶溶液丙烯酰胺储备胶溶液 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 3、1M Tris-HCl(pH 6.8)4、10% SDS 5、10%

9、过硫酸铵（过硫酸铵（AP） 6、TEMED (N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)7、2 SDS电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液 8、ddH2O聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择，分离胶选择pH8.8，选择，选择Tris-HCl系系统，具体作用后面介绍；统，具体作用后面介绍；TEMED与与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；：促凝作用，加速聚

10、丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，）：阴离子去污剂， 作用有四：作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠（部分）。的疏水作用、去多肽折叠（部分）。浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶5% pH6.812% pH8.8蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线，使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度提高解析度。pH不连续凝胶不连续缓冲液成分不连续特点：分离胶孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，可以使样品很好的分离。 当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速

11、率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 pH对整个制胶体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 ddH2O 2.0ml 30%储备胶 1.65ml 1.5M Tris-HCl (pH 8.0) 1.25ml 10% SDS 0.05ml 10% AP 0.05ml 混匀上述液体后加4 l 的TEMED SDS低温（低温（10）下会结晶，冬天配胶时应注意。）下会结晶，冬天配胶时应注意。1、清洗玻璃板，如果是第一次使用的波板，应用洗衣粉泡，超声，自来水冲洗完、清洗玻璃板

12、，如果是第一次使用的波板，应用洗衣粉泡，超声，自来水冲洗完再用蒸馏水冲洗直至不挂水珠，晾干，装胶板，加入蒸馏水再用蒸馏水冲洗直至不挂水珠，晾干，装胶板，加入蒸馏水 ，静置，静置10min观察是否观察是否会漏水，然后倒掉超纯水，用滤纸吸干会漏水，然后倒掉超纯水，用滤纸吸干，应尽量吸干。应尽量吸干。2、制胶（、制胶（5+2）：根据蛋白分子量大小配好分离胶：）：根据蛋白分子量大小配好分离胶：12%分离胶常用按顺序加入分离胶常用按顺序加入各试剂至离心管中，加各试剂至离心管中，加AP（10%）后，轻轻混匀，之后加）后，轻轻混匀，之后加TEMED迅速上胶，灌胶迅速上胶，灌胶待胶面升到绿带中间线高度时即可，

13、然后加满正丁醇待胶面升到绿带中间线高度时即可，然后加满正丁醇/乙醇乙醇封住（为了使分离胶界封住（为了使分离胶界面保持水平，将胶压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；并且阻止空气中的氧面保持水平，将胶压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；并且阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用），让胶自然凝固。气对凝胶聚合的抑制作用），让胶自然凝固。3、待分离胶完全凝固后（约、待分离胶完全凝固后（约4560 min） ，倒去正丁，倒去正丁醇醇/乙醇，乙醇，用超纯水冲洗干净，用超纯水冲洗干净，滤纸滤纸吸干吸干残留水滴。残留水滴。4、加入浓缩胶至溢出，插入样品梳（稍微倾斜插入以减少气泡的产生），让胶自、加入浓缩胶至

14、溢出，插入样品梳（稍微倾斜插入以减少气泡的产生），让胶自然凝固。然凝固。 5、收胶：胶放在电泳液、收胶：胶放在电泳液/水中于水中于4度冰箱保存，拿出来用时恢复到室温。度冰箱保存，拿出来用时恢复到室温。操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间隙操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。，尤其注意底边平齐，以免漏胶。 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心操作。操作。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放灌胶时开始可快一些，胶面快到所

15、需高度时要放慢速度，操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶慢速度，操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水或饱和正丁醇液封时要很中才不会有气泡。加水或饱和正丁醇液封时要很慢，否则胶会被冲变型。慢，否则胶会被冲变型。 室温室温25下凝胶完全聚合约需下凝胶完全聚合约需30-60min。 积层/浓缩胶（4%）的配制 总体积：2ml ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl (pH 6.8) 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml 混匀后 最后加TEMED 2 l 将混合液迅速加入玻璃板间隙，并立即插入梳子将混合液迅速加

16、入玻璃板间隙，并立即插入梳子插梳子时要使梳子保持水平并小心避免混入气泡。插梳子时要使梳子保持水平并小心避免混入气泡。由于胶凝固时体积会收缩减小，会使加样孔变形，由于胶凝固时体积会收缩减小，会使加样孔变形，所以在浓缩胶凝固的过程中要不断补充浓缩胶溶液所以在浓缩胶凝固的过程中要不断补充浓缩胶溶液使之充满梳子间的空隙。使之充满梳子间的空隙。 ：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml， -巯基乙醇巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。 (缓冲液中缓冲液中溴酚兰溴酚兰染料，使样品呈现颜色，从而使加样操染料，使样品

17、呈现颜色，从而使加样操作更为便利；甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀作更为便利；甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔内；进入样品孔内；SDSSDS使蛋白变性并带上负电荷；使蛋白变性并带上负电荷； - -巯基乙巯基乙醇还原蛋白。醇还原蛋白。) ) 蛋白样品与上样缓冲液（蛋白样品与上样缓冲液（5x）按）按4:1的比例混合后，放在的比例混合后，放在100加热器中加热器中加热加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心离心，一周，一周内要做的存至内要做的存至-20，一个月内要做的放于一个月内要做的放于-80 冰箱冰箱。为了防爆

18、管可在离心管上放为了防爆管可在离心管上放 冰块。冰块。四、电泳四、电泳1、将胶板装入电泳槽中，拔出样品梳（拔出来尽量小心、将胶板装入电泳槽中，拔出样品梳（拔出来尽量小心,不要破坏加样孔不要破坏加样孔, 如有胶丝可如有胶丝可 用毛细血管枪头挑出）用毛细血管枪头挑出），清洗泳道清洗泳道。2、将样品放置在冰上，融化后先离心，然后在振荡器上混匀，上样，上样量、将样品放置在冰上，融化后先离心，然后在振荡器上混匀，上样，上样量10-50ug，一孔加一孔加marker，在边缘孔中加入等体积的上样缓冲液，在边缘孔中加入等体积的上样缓冲液 ，以避免边缘效应。，以避免边缘效应。3、在电泳槽内加入足够的电泳液，插好

19、电极，打开电泳仪电源，以、在电泳槽内加入足够的电泳液，插好电极，打开电泳仪电源，以60v电压开始跑分离电压开始跑分离胶，到分离胶时，以胶，到分离胶时，以80-120v跑胶，电泳至溴酚蓝到胶的边缘时结束。跑胶，电泳至溴酚蓝到胶的边缘时结束。注意：注意：1、电泳过程中随时检查内槽的电泳液是否会漏，槽应清洗干净，电极棒注意不能有结晶，、电泳过程中随时检查内槽的电泳液是否会漏，槽应清洗干净，电极棒注意不能有结晶，线不能绕。线不能绕。2、为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳；上样总体积建议为、为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳；上样总体积建议为10-15 L，尽量，尽量不要超过不要超过

20、25 。3、加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品、加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。次，以免交叉污染。4、为了获得更好的重复性，可配、为了获得更好的重复性，可配10或或5X电泳液电泳液母液母液，用时再稀释。，用时再稀释。5、由于变性完的蛋白放在冰箱中会发生复性，所以每次上样前都要进行变性、由于变性完的蛋白放在冰箱中会发生复性，所以每次上样前都要进行变性分钟。分钟。6、电泳前可先用、电泳前可先用10V预电泳预电泳10min使条带更平整。使条带更

21、平整。80V100V浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶 最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。vTris-甘氨酸甘氨酸凝胶可用于分离很宽宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。vTris-tricine最适于分离小小分子蛋白质（150KD），转膜液加），转膜液加0.1%SDS促使跑快点。促使跑快点。但是由于但是由于SDS干扰蛋白与膜的结合，故不能加太多。干扰蛋白与膜的结合，故不能加太多。一般在一般在0.025-0.1%。(SDS有助于大分子量蛋白从凝胶剥离有助于大分子量蛋白从凝胶剥离)高分子量恒流好，低分子量恒压好，因为高分

22、子量要跑比较久，高分子量恒流好，低分子量恒压好，因为高分子量要跑比较久，恒压跑的话跑久电流会往下降。恒压跑的话跑久电流会往下降。1. 称量称量Tris 48.4g，Na2EDTA2H2O 7.44g 于于1L烧杯中；烧杯中； 2.向烧杯中加入约向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；去离子水，充分搅拌溶解； 3加入加入11.4ml的冰醋酸，充分搅拌；的冰醋酸，充分搅拌； 4.用去离子水定容至用去离子水定容至1L后，室温保存，待用。后，室温保存，待用。 Tris-乙酸缓冲液乙酸缓冲液Towbin 缓冲液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇.Towbin

23、缓冲液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇.CAPS缓冲液: 10mM CAPS, 10%甲醇.乙酸缓冲液: 0.7%乙酸Transfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large gels; 5.5 mA/cm2 fo

24、r mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run.1) 为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳。为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳。2) 如用预染如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区分离胶的分离胶的2/3处处 ，结束电泳。，结束电泳。3) 电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。实际电压可根据电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。实际电压可根据时间安排调节，

25、电压高时电泳发热大，电压低于时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。1） 下胶时先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，下胶时先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在边上轻轻的反复撬（玻板很易裂）。要在边上轻轻的反复撬（玻板很易裂）。2） 考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，左右的条带，是最经济通用的蛋白是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。胶电泳染色方法。 3） 考马斯亮兰染色液尽可能过滤后使用，以避免未溶解的考马斯亮兰染色液尽可能过滤后使用，以避免未溶解

26、的染料沉积于胶上。染料沉积于胶上。4） 为减少小分子量蛋白条带的扩散，电泳结束后应该马上为减少小分子量蛋白条带的扩散，电泳结束后应该马上固定或染色。固定或染色。5） 用微波短暂加热使染液升温可以加速染胶，但染色效果用微波短暂加热使染液升温可以加速染胶，但染色效果一般（具体操作：每次加热一般（具体操作：每次加热1-2分钟，分钟，23次，避免染色沸次，避免染色沸腾损坏胶，再摇动染色腾损坏胶，再摇动染色30min以上）。以上）。1：凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，

27、可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 2：电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。 3：指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的中间部分凝固不均匀，或凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致。 4：指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全。 一般浓缩胶电泳的电压是浓缩胶60-80v，分离胶100v。 浓缩胶用较小电压的目的使得

28、loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离胶，理论上（实际上也是）小电压/长时间分离的效果会更好，但是在一般操作过程中没有必要等那么长的时间，所以可用大电压快点跑。为什么通常电泳时浓缩胶和分离胶的电压不一致？ 影响跑胶跑的质量，有以下因素：1、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。 倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。2、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。 3、

29、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。 电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。4、样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素可以克服：由于样品溶解不佳引起的纹理和拖尾现象 。5、减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。 如何使电泳条带漂亮些? 转转 膜膜3 PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 大于20kD的蛋白就可以用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.22m的膜了，如果用0.45m的膜就会发生“Blowthrough

30、”的现象。 关于转印膜的几点说明半干转半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法；适合转移小分子量的蛋白；200 KD以上不能做；半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；用转，根据分子量摸索转膜时间 湿转湿转将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法；适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；湿转时间也是根据分子量而定；封闭封闭+阳极阳极-阴极阴极多孔垫片多孔垫片滤滤纸纸凝凝胶胶膜滤滤纸纸 垫片垫片 3 3层滤纸层滤纸 膜（左上角标记）膜（左上角标记） 凝胶（凝胶（MarkerMarker靠左靠左） 3 3层滤纸层滤纸 垫片垫片白色夹板（正极）白色夹

31、板（正极）黑色夹板（负极）黑色夹板（负极）五、转膜1、将转膜液放在冰箱里预冷，剪好滤纸及PVDF膜（一般长8cm，宽1.5cm），将转膜夹放在盘中，黑色朝下，倒入转膜液；2、凝胶须在电转印缓冲液中平衡15min，除去除去电泳过程中所带的盐盐；在转印过程中，这些盐会引起转印缓冲液导电性升高，产生大量的焦耳热3、卸下胶板放在转膜液中，轻轻拿掉短板，将浓缩胶轻轻刮去，根据marker和指标分子量的大小，切下所需要范围内的胶。4、处理PVDF膜及滤纸：剪滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。按照甲醇浸泡数秒甲醇浸泡数秒- -

32、 超纯水中超纯水中1-21-2min-min-转膜液转膜液10min10min ，滤纸置于转膜液中浸泡。（PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合） 5、放好转膜夹，黑色面放在下面，放入纤维衬垫，在纤维衬垫上放置滤纸（厚的一张，薄的三张）轻轻地将凝胶放在滤纸上，用滚轴赶去气泡。6、接着小心地将印迹膜放在凝胶上，并确保凝胶和印迹膜的位置正确，放置后尽量不要移动转印膜，以防止产生玷污印迹和人为印迹。除气泡除气泡，使凝胶和印迹膜完全地接触。7. 在转膜液中浸润另外一张滤纸，将其放在膜上。8、浸润另一块纤维衬垫，并将其放在滤纸上9、扣好凝胶转印夹，做好

33、标记，将其垂直插入缓冲液槽中，确定转印夹黑色面对应于黑色电极将夹子放在槽中，接通电源，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。按100v恒压在冰浴中转膜，注意监测电流的大小，并作好记录10、转印结束后，取下转印夹，拆卸凝胶三明治装置，TBST 清洗印迹膜。11、半干转时，顺序是滤纸-PVDF膜-胶-滤纸。注意：如果发现转印夹如果发现转印夹夹夹不紧可，多垫滤纸，使其夹紧，否则影响转膜的均匀度。不紧可，多垫滤纸，使其夹紧，否则影响转膜的均匀度。注意：注意：1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸滤纸=膜膜=胶胶。2）滤纸、胶、膜之间千万）滤纸、胶、膜之间千万不能有气

34、泡不能有气泡，气泡会造成短路。，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时必须随时保持湿润保持湿润（干膜法除外）。（干膜法除外）。4）整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。上下滤纸不能相互接触上下滤纸不能相互接触，接触，接触后会发生短路。后会发生短路。 去除非特异结合位点：去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 -3h，或者4孵育过夜.一般磷酸化

35、蛋白不用脱脂奶粉封闭，而选用3%BSA。 糖蛋白有拖尾现象，最好用BSA来封闭 抗抗 体体 检检 测测4单抗多抗将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色缺点：要求抗体浓度高，每种一抗均需用酶来标记将标记物标记在二抗上优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配一抗孵育一抗孵育:拿出合适大小的密封袋，写下抗体名称和日期及类型，配制一抗按拿出合适大小的密封袋，写下抗体名称和日期及类型，配制一抗按1：1000溶于一抗稀释液中，将膜从封闭液中拿出，注意只能夹没有蛋白的边缘部位，溶于一抗稀释液中，将膜从封闭液中拿出，注意只能夹没有蛋白的边缘部位，放置到一抗中，赶出气泡，放置到一抗中，赶出气

36、泡，4度摇床过夜（一般度摇床过夜（一般10-15h)，一抗回收，一抗回收4保存，保存，可用约可用约10天左右。天左右。洗膜：用洗膜：用TBST漂洗漂洗5 minX3次次二抗孵育：二抗孵育：CST: 用用1:2000，溶于二抗稀释液中中，孵育，溶于二抗稀释液中中，孵育1 h（常温摇床）（常温摇床）Pierce 分装：建议分装：建议1:5000-1:100000。Abmart：1:30001:8000洗膜：洗膜：TBST漂洗漂洗5 minX3次；最后用次；最后用TBS 漂洗漂洗5 min。注意：注意：1、避免膜干燥。、避免膜干燥。2、二抗要跟一抗相抗。、二抗要跟一抗相抗。问：问：1、如何判断二抗是

37、否有问题及如何快速摸索最佳二抗浓度？、如何判断二抗是否有问题及如何快速摸索最佳二抗浓度？ 采用斑点法。采用斑点法。 2、如何摸索一抗最佳浓度？、如何摸索一抗最佳浓度？化学发光成像化学发光成像1、打开仪器预热、打开仪器预热(提前提前30分钟），暗箱底座擦干净，铺上保鲜膜，保鲜膜下分钟），暗箱底座擦干净，铺上保鲜膜，保鲜膜下适当加点水使贴住。适当加点水使贴住。2、打开电脑中的、打开电脑中的Image Lab程序程序-新建新建-选择选择-印记印记-chemi-设置（图像时间）设置（图像时间）-放置凝胶，调整大小及位置。放置凝胶，调整大小及位置。2、关闭电灯，按、关闭电灯，按1：1取等量的取等量的EC

38、L发光液（发光液（A、B两液）混合配置化学发光两液）混合配置化学发光液，现配现用。（注意不能有遗漏的地方，观察液面是否完整覆盖住膜）液，现配现用。（注意不能有遗漏的地方，观察液面是否完整覆盖住膜）3、显影液完全覆盖住、显影液完全覆盖住PVDF膜，反应膜，反应1 min，点击运行，尽量避光操作，点击运行，尽量避光操作注意：注意：1、注意避光，发光试剂用完立即放回、注意避光，发光试剂用完立即放回4度。度。2、加化学发光液前应把膜上的水用滤纸吸掉。、加化学发光液前应把膜上的水用滤纸吸掉。3、放置完在对焦下使效果更好。、放置完在对焦下使效果更好。化学发光成像化学发光成像5Western荧光检测取决：荧

39、光检测取决：45KBeta-actin45K35KGAPDH漩涡状条带或条带丢失；转印扩散漩涡状条带或条带丢失；转印扩散1. 印迹膜和凝胶没有密切接触，在二者之间存有气泡或过量缓冲液 使用滚筒小心驱赶印迹膜与凝胶间的气泡或过量缓冲液. 在凝胶和印迹膜两侧使用厚的滤纸. 更换纤维垫，纤维垫随会时间变薄或降解，不能夹紧印迹膜和凝胶.2. 电源条件使用不当 开始前核实电流。在特定电压下，电流可能过高。如果缓冲液使用不当，导电率太高，引起电场强度增大，出现过热现象。3. 印迹膜没有完全润湿或有些干燥 硝酸纤维素膜上的白色斑点表明其润湿不完全，蛋白不能与这些干燥部位结合。如果将印迹膜放在转印缓冲液中很难润湿，可以取蒸馏水加热至接近沸点，将