圆补血口服液对D半乳糖和亚硝酸钠所致痴呆模型小鼠生化指标的影响

1、圆补血口服液对D半乳糖和亚硝酸钠所致痴呆模型小鼠生化指标的影响    【摘要】     目的 研究以何首乌和桂圆肉为原料的乌圆补血口服液对老年痴呆小鼠模型大脑和血液生化指标的影响。方法 用D半乳糖和亚硝酸钠混合液给小鼠腹腔注射，每天1次，连续60 d造模。造模30 d后，治疗组用乌圆补血口服液灌胃治疗，模型组和正常组用等体积蒸馏水灌胃。实验结束，取血分离血清，处死小鼠，取大脑制备10%脑匀浆，测定血清和脑匀浆生化指标。结果 脑匀浆乙酰胆碱脂酶（TchE）活力，模型组、正常组和治疗组分别为(1.709

2、77;0.498)、(1.436±0.313)、(1.182±0.157) U/mg port，模型组明显高于其他两组（P0.05和P0.01）；丙二醛（MDA）含量分别为(7.935±0.775)、(6.934±1.284)、(6.356±0.799) nmol/mg prot，模型组明显高于治疗组（P0.05）；血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活力分别为(329.760±28.438)、(370.038±25.130)、(311.300±29.952) U/ml，正常组明显高于模型组和治疗组（P0.01）；

3、脑（O2）氧自由基清除率（%）分别为(2.346±1.167)、(7.366±3.413)、(8.672±3.519)，治疗组和正常组明显高于模型组（P0.01）；脑蛋白含量、脑GSHPx、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿素等，各组间无明显差异。结论 乌圆补血口服液有明显改善D半乳糖和亚硝酸钠联合痴呆模型小鼠大脑乙酰胆碱酯酶活性和增强抗氧化功能。     【关键词】  老年痴呆症模型；乌圆补血口服液；乙酰胆碱脂酶    老年痴呆症（AD）

4、以认知能力和记忆力迅速减退为主要特征，而认知能力和记忆力目前认为与大脑胆碱能神经有关。乙酰胆碱是胆碱能神经的神经递质，胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱酯酶(TchE)活性分别控制乙酰胆碱的生成和分解。因此，胆碱乙酰转移酶和TchE活性成为测定的重要指标。本研究利用D半乳糖和亚硝酸钠联合造模1，用乌圆补血口服液灌胃治疗，测定大脑TchE活性、丙二醛(MDA)和血清生化指标的变化，并与对照组对比分析。现将实验结果报道如下。    1  材料与方法    1.1  试剂  D半乳糖、亚硝酸钠、氯化钠、过硫酸铵、盐酸羟胺

5、、对氨基苯磺酸、萘胺、HCl、Tris、TEMED、正丁醇，均为国产分析纯。TchE测定试剂盒、MDA测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）测定试剂盒、考马斯亮兰试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿素、丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒，均购自四川省迈克科技有限责任公司。    1.2  动物  小白鼠45只，鼠龄5个月，健康，雌雄各半，由右江民族医学院动物实验室提供。分成3组，每组15只，即模型组、正常组、治疗组。分笼喂养，每笼5只。    1.3

6、  动物实验造模  模型组和治疗组造模。用D半乳糖按100 mg/kg体重剂量，亚硝酸钠按90 mg/kg体重剂量，用生理盐水溶解稀释，两液混合后腹腔注射，每天1次，连续60 d。    1.4  治疗  造模到30 d后，治疗组用乌圆补血口服液，按0.05 ml/只剂量，用蒸馏水稀释至0.3 ml灌胃，每天1次，直至实验结束。其余两组用等体积蒸馏水代替。    1.5  中药  乌圆补血口服液何首乌（制）0.5 g/ml生药（干），龙眼肉0.3 g/ml生药（干）。

7、0;   1.6  测定方法  超氧阴离子自由基（O2）清除率用化学比色法测定2；MDA用TBA（硫代巴比妥酸）显色法测定；GSHPx用其催化H2O2与GSH反应，GSH可与二硫代二硝基苯甲酸作用生成黄色化合物，进行比色测定；TchE测定用TchE催化水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生物TNB黄色化合物，进行比色测定。具体操作按各试剂盒说明书。    实验结束从眼球取血，分离血清待测。处死动物，取大脑，用生理盐水洗去血液，滤纸吸干多余水分，称重，在冰浴下用玻璃匀浆器匀浆，用生理盐水制成10%脑匀浆，在3 50

8、0 r/min离心10 min，取上清于另一试管内，放冰箱内冷冻待用。    1.7  统计学处理  用上海科技出版社SSTP软件（2.00版）处理数据并进行方差分析。    2  结  果    2.1  脑蛋白、TchE和MDA测定结果  见表1。每组脑蛋白无显著性差异（P0.05）；模型组TchE活力明显高于正常组和治疗组（P0.05和P0.01）；MDA含量模型组明显高于治疗组（P0.05）。表1  各组脑蛋白、TchE和MDA

9、比较与模型组比较：1）P0.05，2）P0.01；与治疗组比较：3）P0.05    2.2  血清、脑组织GSHPx、超氧阴离子自由基（O2）清除率测定结果  见表2。血清GSHPx活力正常组明显高于模型组和治疗组（P0.01）；模型组与治疗组尚无明显差异（P0.05）；脑GSHPx活力正常组也高于治疗组和模型组，但尚无明显差异；脑O2清除率治疗组和正常组均明显高于模型组（P0.01），治疗组和正常组无明显差异（P0.05）；脑O2浓度模型组明显高于治疗组和正常组（P0.01）。    2.3  血清A

10、LT、TG、TC、尿素测定结果  见表3。各组间均无明显差异（P0.05）。表2  各组血清、脑匀浆GSHPx活力、脑O2清除率和浓度比较与正常组比较:1)P0.01；与模型组比较：2）P0.01表3  各组血清ALT、TG、TC和尿素含量    3  讨  论    3.1  模型组脑组织TchE活力明显升高  本次实验采用D半乳糖和亚硝酸钠联合造模。D半乳糖注射进入体内后，其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱，体内

11、活性氧水平升高，细胞生物膜脂质受损，脑神经元发生一系列退行性变化，出现AD模型特点。目前也常采用1次性腹腔注射亚硝酸钠120 mg/kg体重造模小鼠记忆障碍模型，由于亚硝酸钠进入体内，使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白而失去携带氧的功能，引起组织缺氧，导致大脑意识和行为上障碍。本次采用90 mg/kg（体重）较小剂量长时间注射，而D半乳糖也采取较小剂量100 mg/kg体重造模。模型组脑TchE活力明显高于正常组（P0.05）和治疗组（P0.01）。文献研究中，有关AD动物模型脑内TchE活性变化的报道不尽一致，有的降低3，有的升高4，5，主要是因为造模方法不同所致。本文采用文献1的造模方法，结果脑

12、内TchE活性明显升高。临床上由于AD病人中TchE活性升高，对AD病人治疗目前最有效的方法是胆碱酯酶抑制剂4，抑制TchE活性而使乙酰胆碱分解减慢，以维持胆碱能神经功能而达到治疗的目的。近年实验研究表明，何首乌有效成分二苯乙烯苷对AD治疗有明显效果3，本实验结果治疗组脑内TchE活性明显低于模型组，而与正常组接近，与文献报道一致6，从而维持胆碱能神经正常功能。    3.2  模型组脑组织抗氧化能力明显降低。模型组脑组织MDA含量和O2浓度明显高于治疗组和正常组6，而O2清除率却明显低于治疗组和正常组。血清GSHPx活力正常组明显高于模型组和治疗组，说

13、明模型组抗氧化能力已明显降低，而治疗组已接近正常组，说明药物对能够防止AD的发生或改善AD的症状，起到治疗作用。    3.3  其他生化指标未见明显变化  ALT、尿素、TG、TC、脑蛋白等各组未见明显差异，说明造模未造成肝、肾系统损害，也未造成脂类代谢障碍。    【参考文献】  1 罗焕敏，陈子晟.一种新的老年痴呆动物模型J.中国老年学杂志，2003；23（3）：17982.    2 萧华山，何文锦，傅文庆，等.一种用分光光度计检测氧自由基的新方法J.生物化学与生物物理进展，1999；26（2）：1802.    3 秦海强，李 亚，田苏平.淀粉样蛋白及D半乳糖对大鼠学习记忆和胆碱酯酶活性的影响J.南京医科大学学报，2000；20（3）：1957.    4 田金洲，杨承芝，杨惠民.复方大黄制剂对老龄小鼠大脑皮质和海马ChAT、AchE活性及Ach含量