破伤风杆菌产毒培养基主要原材料的替代研究.docx

1、论著破伤风杆菌产毒培养基主要原材料的替代研究曹玲，杨海珍,孙一玫，李国晏，谢澎兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的探索用干粉状的肝浸粉、映骼腺、麻踪代替传统破伤风杆菌产毒培养基中使用的猪肝水透析外液、胰酶酪蛋白消化液、浓腺水,以满足规模化生产的需求。方法与传统的破伤风杆菌产毒培养基同时用于破伤风类毒素的生产过程，由小批故生产逐步转化到规模化批髭生产,经多批次试验.以检测不同组分制备的培养基各生化指标和接种细菌后培养的产毒水平进行比对。先确定肝汲粉可以取代猪肝水透析外液，在此基础上徘选出代替浓豚水的脱豚，再以待用的胰酪豚配合肝浸粉、月示盼r制备

2、多批次不同生产量的破伤风杆菌产毒培养基。结果经过多批次小批扩大到批域规模化生产的试验，用肝溪粉、胰酪豚、豚豚配制的破伤风杆菌产毒培养基与传统工艺制备的破伤风杆菌产毒培养基相比较，无统计学意义(P>0.05)o结论肝浸粉、胰酪腺、月示陈可以替代传统破伤风杆菌产毒培养基中的猪肝水透析外液、胰醐酪蛋白消化液、浓豚水.适用于破伤风类毒素的规模化生产。关键词:培养基;破伤风梭状芽胞杆菌;原材料中图分类号：K378.8*!文献标志码：ADOI：10.13309/j.enki.pmi.2014.01.007ThereplacementofmainmaterialsforcultureofClostri

3、dium.tetaniinatoxinproductionmediumCAOling,YANGHai-zhen,SUNYi-mei,UGuo-yan,XIEPengLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:UGuo-yan,E-mail:1)6001Abstract:ObjectiveToexploreusingdrypowderedlive

4、rextractpowder,trypticase,andpeptoneasmainmaterials,itistheneedforlarge-scaleproduction,preparationwascarriedoutforthemediumproductionoftetanustoxininsteadofthetraditionalmediumcontainedliverextracellularfluid,trypsindigestiunofcaseinandconcentratedpeptonewater.MethodsThepreparedrnideaandthetraditio

5、nalmediawerex)山usedinproductionprocessoftetanustoxin,fromasimpleprocedure(oalargescalegradually,differentcomponentsoftheculturemediumwerechangedbythemulti-batchexperimentsandinoculatebacterialseeds,andculturedtoxinproductionlevelswereobtainedandcompared,sodidforindexofbiochemicalstandard.Firstly,ont

6、hebasisofthereplacementofliverextractpowdertotheextradialysisfluid,thenselectionpeptone(oreplaceconcentratedpeptonewaterwascarriedout.Incombinationofthesethreematerialsinatoxinproductionmedium,comparativetestswereperfonnedinbothofmedia.ResultsSeveraltestsarecompleted,fromasmallcapacitytoaproductionp

7、rocess,thebiochemistryindexesareobtainedinmediaaftercultivationofbacteria.Inpreparationoftoxin,themediumconlainedliverextractpowder,irj-pticaseandpeptonewascomparedtothetraditionalmedium,ithasnostatisticalsignificantdifference(P>0.05)inbothmedia.ConclusionsTheliverextractpowder,trypticase,andpept

8、onecanreplacetheliverextra-dialysisfluid,trypsindigestionofcaseinandconcentratedpeptonewaterinthetraditionalmediuminpreparationoftetanustoxininanindustrialproduction.Keywords:Medium,Clostridium,tetani,Rawmaterial破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium,tetani,以下简称为破伤风杆菌)是一种革兰阳性厌氧芽胞杆作者简介：我玲，医学生物学工程师，主要从事细询性疫苗培养基配方选择及制备

9、工作。通讯作者：李国晏.E-mail：S侦)01菌，是破伤风(Tetanus)的病原菌。它侵入伤口内繁殖、分泌内毒素旦引起急性的特异性感染，主要表现为全身或局部肌肉的持续性收缩和阵发性痉挛。1962年,Latham开发出了适合破伤风芽胞杆菌生长的半合成培养基，此培养基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍广泛使用。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液）和牛肉胃酶消化液（浓腺水）为主的基础液，是破伤风杆菌产毒培养基的氮源主要原材料，配合使用的猪肝水透析外液是提供破伤风杆菌生长所需要的生长因子和微量元素。这些基础液都是自制、以液体形式保存，每次制备费时费力、制备量有限，仅能满足传统玻璃立瓶培养的需要。随着新

10、技术的开发应用，破伤风类毒素的需求量逐步急剧增加，迫使传统的生产工艺发生改变，由玻璃立瓶培养转变为发酵罐培养，制备的一批基础液难以满足规模化连续批量发酵罐培养的要求。从2008年起，尝试用新的原材料替代生产中原来使用的培养基组分。1材料与方法11材料20%胰酪消化液,浓豚水，猪肝水透析外液，胰酪K（OXOID,Solabia），月示豚（BD）,脱豚（NZP）,肉豚（NZP）,肉豚（美国），肝浸粉，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，结晶乙酸钠，硫酸镁，葡萄糖，甘油，氯化高铁,B族维生素（B】、B2、B6、BQ,尿嗟嚏,泛酸钙，烟酸，无水乙醇，盐酸，注射用水等。12仪器培养基制备罐（1200LJOOL）,发

11、酵罐（1200L、500L、300L）,玻璃立瓶，电子天平,pH计，量筒，量杯，吸管等。1.3方法131培养基的制备方法先在培养基制备罐中注入适量注射用水，根据破伤风培养基的氨基氮含量的要求,控制基础液或主要原材料中的氮源，精确计算称量后,加入培养基制备罐中，加热并充分搅拌至完全溶解;逐一加入其他各项材料,充分搅拌均匀至完全溶解，调节pH值至所需，加热煮沸，复调pH值至所需，补充注射用水至制备总量，搅拌均匀，过滤，滤液注入玻璃立瓶或发酵罐中，经高压灭菌后使用。L3.2破伤风产毒培养基的质量检测方法主要检测项目为：氨基氮含量"】，总氮含量l21,pH值,Fe，,含量。1.3.3破伤风杆

12、菌产毒方法注入玻璃立瓶或发酵罐中经高压灭菌后的培养基，调节至所需温度，接种破伤风杆菌，经培养并检测其产毒水平。1.3.4破伤风毒素的检测方法按文献5方法进行。1.3.5破伤风杆菌产毒培养基中主要原材料的替换试验破伤风杆菌产毒培养基中肝浸粉替代猪肝水透析外液的试验。在破伤风产毒培养基中，猪肝水透析外液提供破伤风杆菌生长所需要的生长因子和微量元素，所起的作用比较容易用其他相似产品替代。首先将猪肝水透析外液用经试验后的肝浸粉替代，再对胰酪消化液和浓豚水做替换试验。用胰酪消化液和浓豚水作基础液，分别以猪肝水透析外液和肝浸粉制备培养基，在装有培养基的玻璃立瓶和发酵罐中同时接种破伤风杆菌进行培养，与用猪肝

13、水透析外液和肝浸粉制备的培养基培养的破伤风杆菌产毒水平相比较,以探索肝浸粉能否替代猪肝水透析外液。破伤风杆菌产毒培养基中豚豚的选择和脉豚替代浓豚水的试验。确定用肝浸粉代替猪肝水透析外液后，在保证培养基中其他组分不变及不加入浓豚水的条件下，使用商品化的干粉豚类产品制备培养基，同时接种破伤风杆菌进行培养。对待选的美国肉豚、NZP肉豚和脉肱X所配制的培养基进行生化检测和破伤风杆菌产毒水平的分析，选择其中可用的肱类产品。破伤风产毒培养基中胰酪肱代替胰酶酪蛋白消化液的试验。选用某品牌的胰酪豚，以期代替自制的胰酶酪蛋白消化液。在其他组分不变时,配合不同的豚类产品，制备不同组别的破伤风杆菌产毒培养基,同时接

14、种培养破伤风杆菌。对所配制的培养基进行生化检测和破伤风杆菌产毒水平的分析，以确定所选用的胰酪腺能否可用于制备其细菌产毒培养基,并确定配合使用最佳的豚类产品。主要原材料置换后小量破伤风产毒培养墓的生化检测和其培养的产毒水平。用选定品牌的肝浸粉、胰酪腺、脉豚作主要原材料，配合培芥基中的其他组分，制备小量（54L）破伤风杆菌产毒培养基以及与同期的传统培养基（540L）,接种破伤风杆俯。检测其培养基的生化指标和破伤风杆前的产毒水平。主要原材料置换后扩大制备量的破伤风杆菌产毒培养基的生化检测和其培养产毒水平。用选定的肝浸粉、胰酪豚、豚豚作主要原材料，配合培养基中的其他组分，制备500L破伤风杆菌产毒培养

15、基及同时生产传统培养基540L,接种破伤风杆菌。检测培养基的生化指标和其细筋产毒水平。2结果2.1破伤风杆菌产毒培养基中肝浸粉替代猪肝水透析外液的试验结果从表1中可以看出，组1和组3中相同菌种分别接种相同培养基的大罐和立瓶培养，由于两种生长环境不同,大罐培养产毒水平高于立瓶;组2、组3用肝浸粉代替猪肝水透析外液进行立瓶培养,产毒水平与组】用猪肝水透析外液作原料的培养后产毒差异无统计学意义（P>0.05）；组3用肝浸粉代替猪肝水透析外液进行逐步放大量的大罐培养,产毒水平与组1和组2用猪肝水透析外液作原料的培养后产毒差异无统计学意义（P>0.05）。从以上数据中可以得出，在培养基的原材

16、料中，用肝浸粉可以替代自制的猪肝水透析外液。表1肝浸粉替代猪肝水透析外液的试验结果Tab.!Replacementofliverextractpowdertopigliverextra-dialysisfluid组别制备域生产批次肝浸粉猪肝水透析外液产毒(x±s)(U/mL)1大瓶(60L)9无有45.00±15.81大罐(60L)18无有64.66±17.88大瓶(60L)12有无67.08±10.332大罐（60L）20无有91.32±14.51大瓶(60L)8有无52.50±10.61大罐（60L）8有无75.00±)

17、7.323大罐（120L）6有无68.23±18.37大碾(300L)6有无71.89±19.32大罐(700L)6有无81.67±17.592.2破伤风产毒培养基中豚腺的选择试验从表2中可以看出，不使用族类氮源的培养基，破伤风杆菌不产毒，在待选用的豚类中，美国肉豚较NZP肉腺和脉豚X,虽然生化检测结果基本上无差异，但是单独使用美国肉豚的培养基破伤风杆菌不产毒,NZP肉豚和脉豚X可用于进一步的试验中。表2破伤风产毒培养基中脆豚的选择试验结果Tab.2Theresultsofpeptoneselectiontestsfortetanustoxinproduction

18、medium组别批次浓冻水豚类培养基生化检测G）产毒G)(Lf/mL)TN(mg/mL)AN(mg/mL)PHFe”(|xg/mL)12无无0.120.086.930.06不产毒22有无1.890.837.030.4642.2134无美国肉豚2.210.897.010.48不产毒43无NZP肉豚2.340.876.930.6640.4653无脉豚X2.140.827.030.3641.672.3破伤风产毒培养基中胰酪踪代替胰酪消化液的试验试验结果表明，未使用胰酪豚作氮源的培养基，破伤风杆菌不产毒，在待选用的胰酪豚中，二者的产毒水平差异无统计学意义（尸>0.05）。以待选用的两种胰酪腺与胰

19、酪消化液分别制备培养基培养破伤风杆菌，产毒水平前者明显高于后者。表明两种待选用的胰酪豚都可替代胰酪消化液作为制备培养基的原材料，见表3。2.4主要原材料替代后小量破伤风杆菌产毒培养基的生化检测和其培养后的产毒水平试验结果显示,用选定的肝浸粉、胰酪豚和脉腌制备的小量培养基,及用传统的猪肝水透析外液、胰酪消化液和浓豚水制备的培养基，经生化检测和其培养破伤风杆菌产毒水平的结果相比，二者差异无统计学意义（P>0.05）,见表4。2.5主要原材料替代后扩大破伤风杆菌产毒培养基制备量的生化检测和其培养的产毒水平从表5可以看出，在制备量扩大的情况下，用选定的肝浸粉、胰酪腺和廊豚的培养基及用传统的猪肝水

20、透析培养破伤风杆菌产毒水平的结果相比，.二者差异无统外液、胰酪消化液和浓腺水培养基，经生化检测和其计学意义(P>0.05),可以用于破伤风杆萌的培养。衰3破伤风产毒培养基中胰骼豚的选择试验Tab.3TlieresultsofselectionIryplicasctestsfortetanustoxinproductionmedium组别批次胰潞消化液胰慌陈12X无28有无35无0X01D46无SolabiaTN(mg/mL)AN(mg/mL)pHFe"(成mL)0.120.086.930.06不产密2.480.847.010.7150.64*18.563.070.976.970

21、.1470.54±12.333.231.027.090.3668.85±16.15培养基生化检测G)产毒G)表4小量破伤风杆菌产毒培养基生化检测和其培养后的产毒水平Tab.4Biochemicalindexesandlevelsofloxinpreparedinmediumcontainednewmaterialsinasmallscaleproduction原材料培养基生化检测(*)产毒(*)制备批次,TN(mgZmL)AN(mg/mL)pHFe(g,g/mL)(II/tnL)传统法制务的培养基下粉制备的培养基484.311.077.09I.1464.43±14

22、.86302.550.886.781.0560.00±11.35Tab.5Biochemicaldetectionandlevelsoftoxinpreparedinmediumcontainednewmaterialsinalargescaleproduction表5扩大的破伤风杆菌产毒培养基生化检测和其培养的产毒水平原材料.Q培养基生化检测G)产毒(X)制备批次TN(mg/mL)AN(mg/mL)pHFe,*(p/mL)(U/mL)传统法制备的培养基干粉制备的培养基484.381.117.050.8963.19±16.62483.420.946.940.9585.34&

23、#177;I3.733讨论培养基是微生物生长所需要的各种营养物质人工配制而成的一种混合基质，用于培养和分离各种微生物,根据微生物种类和培养目的不同，培养基有不同的种类和制法。破伤风类毒素的生产培养基一般采用酪蛋白、牛肉等蛋白质在较温和的条件下加深水解后制成基础液'6)。水解程度的深浅直接影响产毒的高低，蛋白水解液中的肽类是促进细荣产毒的主要物质。有时补充牛心浸液。发酵舞培养的使用更进一步提高了破伤风类毒素的产最和质最。传统的破伤风杆菌产毒培养基，一般含肉类(乳牛心浸液BHI)或乳类(酪蛋白消化液中的N-Z-CaseR或N-Z-CaseTTR)制品，其他还有葡萄糖、氨基酸、维生素、尿唆嚏

24、和无机盐等。已经证明，N-Z-CaseR或N-Z-CaseTTH对细菌生长是必需的。目前使用的下酪索胰酶消化液(胰酪消化液)和杓酶牛肉消化液(浓豚水)是作为破伤风杆菌产毒培养基氮源的主要原材料，但是随若生产规模的扩大，制作一批基础液已经不能保证生产的连续多批次使用。为解决上述问题，从2008年开始将破伤风杆菌产毒培养基的主要原材料胰酪消化液、浓豚水、猪肝水透析外液用商品化的类似原材料代替。先保持胰酪消化液、浓豚水和其他组分不变，尝试应用肝浸粉替代猪肝水透析外液，并从培养基制备量小(60L)逐步扩大到制备量为12()L、3()0L、700L各6批，通过生化检测和破伤风杆菌产毒水平试捡，同时用猪肝

25、水透析外液的培养基接种破伤风杆菌的产毒水平进行对比，其结果显示差异无统计学意义。因此，用肝浸粉可以替代猪肝水透析外液。接智尝试应用胰酪踪替代胰酪消化液制备破伤风杆菌产毒培养基11批,试验生产量为18L,同时以胰酪消化液和浓豚水为基础液的培养基540L,对其生化指标质量控制和接种破伤风杆菌的产毒情况进行了比较;2009年，用胰酪腺和不同的脉豚作试验培养基，同时用胰酪消化液和浓豚水为基础液的培养基540-670L,对质量控制牛.化指标和细菌产毒情况进行了对比，选择出一种口J用的腕豚以替代原来的浓豚水;2010年匕半年街种用培养基沿用传统的原材料配制，试验选用胰酪肱和所腺制备破伤风杆菌产毒培养基制备

26、量54L30批次，同时使用胰酪消化液和浓豚水为基础液进行质M控制和破伤风杆菌产毒水平对比;2010年下半年菌种用培养基选用胰酪豚和豚腺，试验选用胰酪豚和月示腺制备破伤风杆菌产毒培养基,制备量依次为36、72.500和520L各3批次逐渐扩大，检测培养基的质量控制生化指标和产毒情况进行试验，完成从小技到大量的原材料替代试验。而2012年，选用的胰酪豚和脉豚替代传统自制的胰酪消化液和浓豚水制备破伤风杆菌产毒培养基，大罐制备量为500L共48批次,其培养基检测的各项生化指标稳定，产毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪腺和脉腺替代传统原材料制备的培养基易于生化指标的质量控制，可适用于破伤风杆菌产毒规模化的生产

27、。参考文献国家药典委员会.中华人民共和国坊典（三部）（s.北京：中国医药科技出版社.2010：MA氮测定法：附录33.1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）S?.北京：中国医药科技出版社,2010：VIB蛋门质测定法：附录34-35.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）S.北京：中国医药科技出版社,2010；VApH值测定法:附录25-26.国家药典委员会.中华人民共和国街典（二部）SJ.北京：中国医药科技出版社.2010：llG铁盐检查法:附录57-58.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）S.北京：中国医药科技出版tt.2010：XID类毒素絮状单位测定法:附录82.6 赵铠,章以浩，李河民.医学生物制品学S.2版.北京:人民卫生出版社,2007:697-7（）2.*7DemainAL.GersonDF,FangA.Effectivelevelsoftet