第十章其它分析方法和分析技术

1、第十章其它分析方法和分析技术高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近年来发展起来的一种高效、快速的分离分析技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。HPCE已成为一种重要的分离分析方法，在生物、医药、化工、环保、食品等领域具有广阔的应用前景。总的说来，HPCE具有如下优点：1. 高灵敏度 采用电化学检测器，最低检测限可达10-19 mol；2. 高效 HPCE每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万甚至几千万；3. 高速 通常的分析时间不超过30 min。有1.7 min内分离19种阳离子及3 min内分离30种阴

2、离子的报道；4. 样品用量少 只需nL（109 L）级；5. 低消耗 每次分析只需少量（几毫升）流动相，分析过程是在价格低廉的毛细管柱中进行；6. 应用范围广 从简单的无机离子、有机离子到整个细胞，都可进行分离分析。具有“万能”分析功能或潜力； 一、基本装置与原理一、基本装置与原理HPCE是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配系数的不同而进行分离的一类新型液相分离技术。毛细管电泳一般由一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个缓冲液贮液槽及数据记录系统组成，其仪器结构示意图如图 1234655图图108 毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图1高压电源

3、高压电源 2检测器检测器 3液冷温控毛细管液冷温控毛细管 4数据记录系统数据记录系统 5缓冲液槽缓冲液槽 6缓冲液缓冲液1.基本装置HPCE的仪器结构比HPLC仪简单，有高压直流电源，进样装置，毛细管和检测器。前三个部件均易实现，但由于HPCE采用了极小内径的毛细管，进样量很小，因此只有具有高灵敏度的检测器，才能进行定性、定量分析。检测器是HPCE仪的关键部件。 HPCE检测器中应用较广泛的是紫外-可见检测器和电化学检测器。迄今为止，除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱（ICP）及红外光谱未用于HPCE外，荧光、电化学、质谱、激光类和其他类型检测器（如折射率检测器、同位素检测器等）均已应

4、用。目前应用较多并且已经商品化的是光学检测器（紫外检测器和荧光检测器）和电化学检测器（电导和安培）。电化学检测器由于其灵敏度高、价廉、应用范围广，应用比较多。HPCE-MS联用提供了一种分离和鉴定相结合的强有力的技术，将成为最有发展前途的技术之一。 2基本原理 在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称为电泳。电渗流（electroosmoticflow，EOF）是指管内溶液在外力电场作用下整体向一个方向运动的现象。HPCE通常采用的是石英毛细管柱，一般情况下（pH3），硅醇基（SiOH）电离为硅氧基负离子（SiO），使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶

5、液中水合离子（一般为阳离子）被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加高电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流。在不少情况下，电渗流的速度是电泳流速度的57倍。溶液中同时存在泳流和渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电解质中的运动速度应当是电泳流速度（ ）和电渗流速度（ ）的矢量和，即 epeoE)(epeoepeo式中，E为电场强度，为淌度。正离子的运动方向和电渗流一致，因此最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，其移动速度相当于电渗流速度；而负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，

6、故它将在中性粒子之后流出，各种粒子的分离情况见图 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

7、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -图图 毛细管分离示意图毛细管分离示意图在HPCE中电渗流的一个重要特点是具有平面流型，电渗的驱动力沿毛细管均匀分布，它使整个流体象一个塞子一样以均匀的速度向前运动。而在HPLC中流体流型则是抛物线型的层流，其中心处速度是平均速度的2倍。电渗流的平面流型和HPLC中高压泵驱动所产生的抛物线型层流的速度曲线不同，不会直接引起样品组分区带在柱内扩张，这是HPCE获得高效分离的重要原因之一。 HPCE是指所有在极细毛细管内进行的电泳新技术，它根据分离机理不同，具有多种分离模式，能够提供多方面的信息。HPCE

8、常用的分离模式包括： 二、常用分离模式二、常用分离模式又称自由溶液毛细管电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最广泛的一种分离模式。在毛细管中仅填充缓冲溶液，基于溶质组分的迁移时间或淌度的不同而分离。前述基本原理即为CZE的基本原理。 1毛细管区带电泳毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis；CZE） CZE的特点是操作简便、快速、分离效率高、应用范围广，从理论上讲适用于分离所有具有不同淌度的荷电粒子，分子量范围从十几的小分子离子到几十万的生物大分子。 胶束电动毛细管色谱又称电动色谱（EKC），是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，既能分离离子型物质，又可分离

9、中性物质。 2胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography；MECC） MECC是在电泳分离缓冲溶液中加入离子型表面活性剂并形成胶束，使电中性物质能根据其在胶束相和缓冲溶液相中的分配系数不同而进行分离。MECC的分离原理包括胶束增溶和电迁移两个过程。其分离介质包括两相，一相是带电的胶束（不固定于柱的准固定相），它具有与周围缓冲溶液（流动相）不同的电泳速度，并且与被分离溶质相互作用（胶束增溶过程）；另一相是缓冲溶液相，在电场作用下，以电渗流的方式整体向阴极流动（电迁移过程）。例如，在缓冲溶液中加入十二烷基硫

10、酸钠形成胶束，因其表面带负电，电泳方向与电渗相反，向阳极泳动。在缓冲溶液pH5时，电渗流速度大于胶束电泳速度，所以胶束的实际移动方向和电渗流方向相同，都向阴极移动。电中性溶质基于色谱分配原理，在高压电场作用下移动的缓冲溶液相和胶束相之间进行分配，疏水性较强的溶质在胶束中的分配系数大，进入胶束中的溶质较多且较稳定，相对于疏水性较弱的溶质迁移慢。因此，中性溶质按其疏水性不同，在两相间的分配系数不同而得到分离。图为MECC的分离原理示意图。 表示载体表示载体， 表示溶质表示溶质，表示载体的电泳表示载体的电泳迁移迁移， 大空心箭头表示电渗流大空心箭头表示电渗流+）（图电动色谱原理图图电动色谱原理图CG

11、E是80年代后期发展起来的毛细管电泳的主要分离模式之一，它将凝胶电泳对生物大分子的高效分离能力和毛细管电泳的快速、微量和定量分析相结合，成为当今分离度极高的一种电泳分离技术。 3毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE） 在CGE中，溶质的分离依赖于溶质的净电荷性质和分子大小两个因素。在毛细管中装入凝胶作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性的网络结构，对溶质具有分子筛的作用。当带电溶质在电场作用下通过凝胶的网络结构时，将会对不同大小的溶质分子产生不同的阻力，使溶质按分子大小逐一分离。尤其对那些荷质比不随分子大小而变的大分子如DNA等，没有凝胶

12、的筛分作用就不能分离。而且凝胶的粘度大，可减少溶质的扩散，使被分离组分峰形尖锐，能达到CE中最高的柱效。 CGE在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广阔的应用。在分子生物学上实现了包括寡聚核苷酸纯化、DNA测序和PCR产物的分析，在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质分子的分子量测定，原蛋白和结合蛋白的分离等。此外，CGE还可用于其它带电物质的分离，并可通过加入手性试剂、离子对试剂、络合试剂等添加剂改变分离的选择性。 CIEF即是在毛细管里进行的等电聚焦过程。由于毛细管本身的抗对流性质，CIEF可在自由溶液中进行，也可在凝胶中进行。CIEF集传统等电聚焦和毛细管电泳高效、快速、微量及柱上检测等的优点，

13、在蛋白质、多肽的分离分析上有很好的应用前景。 4毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing；CIEF） CIEF是根据蛋白质的等电点（pI）不同而进行分离的。基本原理是基于两性电介质在分离介质中的迁移造成的pH梯度，由此可以使蛋白质根据它们不同的等电点达到分离。采用两性电解质混合物作为载体电解质，当在毛细管两端加电压时，pI大于两性电解质混合物pH值的两性电解质带正电，向负极移动；pI小于两性电解质混合物pH值的两性电解质带负电，向正极移动；当它们移至pH=pI值区带时，净电荷为零，不再移动。因此不同等电点的两性电解质在电场中从阳极到阴极按pI值

14、逐渐增加排序，形成稳定的pH梯度，梯度中每一处的pH，取决于该处两性电解质的pI值。同理，具有一定等电点的蛋白质顺着这一梯度迁移到相当于其等电点的那个位置，并在此停下，产生非常窄的聚焦带，并使不同等电点的蛋白聚焦在不同位置上。CIEF有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于单位的两种蛋白质。 除了以上分离模式外，毛细管等速电泳（capillary isotachorphoresis；CITP）是一种较早的模式，目前应用不多；毛细管电色谱（capillary electrochromatography；CEC）是将HPLC中的各种固定相微粒填入毛细管，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以

15、电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽然柱效有所下降，但增加了选择性。 离子色谱一、概述 离子色谱法（Ion Chromatography，IC）是一种利用色谱分析的原理，对混合离子进行分离和定量测定的方法。它类似于高效液相色谱法，并随着高效液相色谱技术的发展而发展。目前，被广泛地应用于无机、有机阴阳离子的连续分析。 电离常数大于107的物质，就可以用离子色谱法进行测定。其特点是：1. 选择性好，干扰少，样品不需要复杂的处理；2. 操作简单快速，几分钟可测定多种离子；3. 灵敏度高，检出浓度可达mol/L级； 4. 准确度高，误差小于5%。 目前离子色谱有多种类型，常用的有高效离子色谱法、高效离子

16、排斥色谱法和流动相离子色谱法。 一、高效离子色谱法的基本原理 高效离子色谱同样遵循色谱基本理论。如在分离原理、色谱峰扩张的解释中，都应用了经典的气相色谱理论。 离子色谱的固定相是离子交换树脂。在固定相的表面，分布着许多适合于分离阴离子的活性中心（如： ，或适合于分离阳离子的活性中心（如： ）。当被测定的混合离子随流动相（淋洗液）流经固定相时，由于不同离子的电荷数OH)N(CH33HSO3或离子半径不同，使它与固定相的作用力大小不同，造成各种离子在相对运动的两相之间的分配系数不同，因此，它们在柱中的迁移速度也就不同，从而达到分离的目的。 从下图可知，电荷和半径较大的离子出峰较慢。 0 2 4 6

17、 8 t/min图图105 几种阴离子的离子色谱图几种阴离子的离子色谱图ClF-24HPO-24HPO-24SO 高效离子排斥色谱：其分离原理是以树脂的Donnan排斥为基础。 分离阴离子用强酸性高容量交换树脂为固定相，分离阳离子用强碱性高容量交换树脂为固定相。在亲水性固定相中，固定相表面形成带负电荷的Donnan膜，该膜只允许未解离的分子通过。 例如流动相为无机强酸水溶液，被测组分为有机弱酸，由于有机弱酸的离解常数小，在硫酸水溶液中呈为解离状态，所以，可通过Donnan膜，并在固定相和流动相之间进行分配，而以离子形式存在的其他组分则被排斥在Donnan膜外，随流动相很快流出。 流动相离子色谱

18、法：固定相是非极性的，在流动相中加入与待测离子电荷相反的离子对试剂，如阴离子表面活性剂，离子对试剂与电荷相反的待测离子形成不带电荷的疏水性的离子对而保留在固定相。 二、离子色谱仪的装置 贮液罐 泵 进样器 分离柱 抑制柱 检测器图图106 离子色谱图流程示意离子色谱图流程示意图图废液（一）输液系统 常用双柱塞式往复平流高压泵作输液泵，以获得平稳的液流。由于淋洗液、再生液和冲洗液通常由具有腐蚀性的强酸强碱配制，因此，贮液罐多用聚乙烯塑料瓶。 （二）进样器 多由六通阀进样，既保证了进样量的准确性，也使自动化进样成为可能。 （三）分离柱 离子色谱柱用不锈钢、玻璃或聚三氟氯乙烯塑料制成，内填离子交换树

19、脂。常用的有薄壳型离子交换树脂。不同型号的交换树脂，由于其交联度、直径和基团的不同，具有不同的交换容量，其分离效率也就不同。 （四）抑制柱由于淋洗液多由强酸强碱或盐组成，流动相中存在着大量的H+、OH-或其它阴阳离子，使得检测信号的噪声水平很高。如用电导检测器时，由于大量杂质离子的存在，使溶液的总电导很大，甚至掩盖了待测离子的信号。因此，有必要在检测器前方加一个抑制柱，以去除或减小这些杂质离子对测定的干扰。 常用的抑制柱，由强酸或强碱型离子交换树脂组成。强酸性阳离子交换树脂抑制柱，可通过释放H+离子，中和分析阴离子时存在的大量OH离子；同理，为了中和分析阳离子时存在的大量H+离子，可选用强碱性

20、阴离子交换树脂抑制柱。 目前，还研制了利用离子交换半透膜进行杂质离子分离的纤维膜抑制柱，加装正、负电极促使杂质离子加速分离的电化学抑制柱。抑制柱常使色谱峰展宽，导致分辨率下降。 （五）检测器 最常用的检测器为电导检测器，其结构简单，可检测出g/L级的离子浓度。对光有吸收的离子，可采用紫外可见光度检测器；有荧光的离子，可选用荧光检测器。还可以通过柱后衍生的方法，生成其他物质进行间接测定。 三、离子色谱分析条件的选择（一）分离柱的选择 高效离子色谱法（HPIC）分离柱的填料，是低交换容量的离子交换树脂。HPIC分离柱的树脂核，由苯乙烯或二乙烯苯的聚合物制成。外层覆盖具有活性中心的离子交换树脂。树脂

21、核半径的大小、基团的种类和交联度，决定了柱子的柱效。目前使用的阴离子分离柱的型号为AS1AS7。对于高保留、难分离的离子，如SCN-、WO42-等，可用AS5柱进行分离；AS7柱甚至可分离低聚糖、多聚磷酸盐等强保留物质。阳离子分离柱的型号为CS1CS5，可分别用来分离易分离的碱金属离子，以及难分离的过渡元素金属离子。 （二）洗脱液的选择 弱保留离子（低价、半径小的离子：如F-、S2-等），可用弱洗脱液（如HCO3-、OH-等）；中等保留的离子（如SO42-），用中等强度的洗脱液（如OH-/HCO3-）；高保留的离子（如SCN-、I-）可用高强度洗脱液（如：OH-/CO32-/甲醇） 洗脱液的p

22、H值和浓度，也是影响保留时间的重要因素。洗脱液的浓度大，洗脱能力强，出峰快；洗脱液的pH值增大，可改变离子的形态，如HPO42-转变为PO43-，有机弱酸的电离度也增大，从而影响到色谱分离的效果。 对于不同的抑制柱，也应选用合适的洗脱液。如用离子交换树脂抑制柱时，可用盐酸或氢氧化钠为洗脱液；使用纤维膜抑制柱时，应以烷基磺酸盐为洗脱液。 （三）流速的选择 流速大，出峰快，但分离度降低；流速小，分离度提高，但较费时间。需通过实验确定合适的流速，一般设定不大于1 ml/min。有时用梯度洗脱的方法，分离不同组的具有相近保留值的离子。 四、离子色谱分析的应用实例生物体中多种含氧阴离子的分析 含氧阴离子

23、广泛地分布于环境中，铬酸根、硒酸根等被认为是有毒性或有潜在毒性的离子，而有些含氧阴离子又是生物体必需的离子。 在含有阴、阳离子双官能团的色谱柱上（CS5A柱），使用两种不同浓度的Na2HPO4洗脱体系，用紫外分光光度检测法（204 nm），同时分离测定了5种和7种含氧阴离子（如图）。方法的相关系数为；RSD为0.9%2.6%；检测限达mg/L级。 图图 用用7.5 mmol/L Na2HPO4洗脱液的离子色谱图洗脱液的离子色谱图0 2 4 6 8 10 t (min)3IO32AOH3BrO3NO2NO0 4 8 12 16 20 24 t(min)24MoO24HAsO24SeO24WO24MoO23GeO24CrO原子荧光分析法 原子荧光分析法，又称原子荧光光谱法，AFS。是通过测量元素的原子蒸汽在特定频率辐射能激发下所产生的荧光强度来测定元素含量，具有原子吸收和原子发射光谱两种技术的优点。 一、基本原理 气态原子吸收了由激发光源发出的特征辐射后，原子外层电子从基态或低能