银杏叶黄素的提取及紫外光谱表征

1、浙江农林大学开放性实验论文 项目名称 银杏叶黄素的提取及紫外光谱表征学院班级 理学院 姓名 王卉殊 学期 2012-2013年第一学期 银杏叶黄素的提取及紫外光谱表征 班级:应用化学112班 姓名：王卉殊摘要：本实验用乙醇提取，通过氧化铝柱层析，用正己烷洗脱，得到的叶黄素。即可除去银杏叶中大量的醇溶性杂质，又可得到了纯净的叶黄素。将叶黄素用紫外分光光度计表征，确定其最大吸收波长。关键词：银杏叶，叶黄素，提取，柱层析，紫外分光光度计1 文献综述1.1 银杏叶的概述银杏叶（Ginkgo Leaf）是近年来国内外药物开发和研究的热点之一，其脂溶性提取物主要成分为黄酮和内酯类化合物，已被广泛应用于心脑

2、血管疾病的治疗。银杏叶，性味苦甘涩平，内含双黄酮，经实验和临床证明，它具有降低血清胆固醇、扩张冠状动脉的作用，对于冠心病、高血压有一定的辅助治疗作用.1叶黄素是一种无维生素A 活性的类胡萝卜素，属纯天然色素，无毒副作用，不溶于水，溶于油脂、乙醇等。叶黄素有八种异构体，以全反式为主，一般从植物中提取。叶黄素广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中，属于“类胡萝卜素”族物质，而类胡萝卜素是国际公认的具有防病抗病生理功能的天然物质，其主要功能是单线态氧的有效淬灭剂，能消除羟自由基，是脂类过氧化反应的断链抗氧化剂，在细胞和细胞膜中和脂类结合而有效的抑制脂类的氧化，对于人体疾病的预防发挥重要的作用。开

3、发利用银杏叶黄素对于丰富叶黄素来源，提高银杏叶的价值具有重大意义。1抗氧化剂是一种在植物中广泛存在的化学物质，能够和体内的自由基广泛结合，发挥抗氧化作用。自由基可以提高机体的氧化作用，杀死体内的有害菌并产生能量，但过量的自由基将损害细胞，危害健康。随着对抗氧化剂研究的不断深入，人们认识到不同的抗氧化剂在体内执行不同的生物学功能。叶黄素（Xanthophylls）是一种性能优异的抗氧化剂，是构成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分之一，叶黄素在甘蓝、羽衣甘蓝、菠菜等深绿色叶菜以及金盏花、万寿菊等花卉中含量最高。在南瓜、桃子、辣椒、芒果、柑橘、蛋黄中则含丰富的叶黄素前体叶黄素酯。人类的眼睛黄

4、斑区含有高浓度的叶黄素，是构成人眼视网膜黄斑区域的主要色素2，但在人体内无法制造，必须靠含叶黄素的食物来补充，若严重缺乏这种色素，眼睛就会失明。 1.2 叶黄素化合物的研究进展国外对叶黄素的研究已有10 多年的历史, 在开发应用叶黄素方面, 美国Kem in 公司、瑞士Roche 公司处于研究的前沿。除了美国和瑞士的公司外, 日本和德国的一些公司也均有叶黄素及其保健产品的研究与生产。在国际市场上, 含叶黄素的保健食品和营养补充剂的价格约为35 45 美元ö瓶, 其中50 粒(胶囊)ö瓶, 20mgö粒(胶囊) , 叶黄素产品的利润空间十分丰厚3。近几年, 国内的青

5、岛大学天然产物研究所、北京大学、中国农业大学等单位均开展了叶黄素研究工作。广州市范乐医药科技有限公司与瑞士Roche 公司合作生产的以叶黄素为主要有效成分的维视保软胶囊已经面世。但是, 与国外的研究进展相比, 国内的研究与生产水平还有一定差距。开发和研制高纯度叶黄素, 研究其稳定剂型, 拓宽其应用领域, 使其产业化, 将是我国研究人员今后的一项重要工作。1.3 叶黄素化合物的提取方法分离及提取 (1)、膜分离技术。 用陶瓷膜微滤(MF)对浸提液进行精滤提纯，再用反渗透膜(R0)浓缩过滤液。这种工艺以膜分离技术为主体，替代了传统的酒精提纯和蒸发浓缩，工艺过程简单、色素溶液基本处于常温操作状态，既

6、节约能源，又保证了色素产品的质量。 (2)、干燥法提取叶黄素。 研究出一种新型转筒式干燥机，用来干燥和捶击金盏花或者万寿菊花瓣，可以从中提取叶黄素。当捶击比率不同时，捶击效率就在70%90%之间波动。叶黄素的多少决定于干燥时间长度。但在相同的干燥时间里，70下干燥提取的叶黄素含量比60下提取的叶黄素含量要少。 (3)、高效液相色谱分析法提取。 以二氯甲烷(22.5mL)+乙腈(9.5mL)+甲醇(67.5mL)+水(0.5mL)为流动相，流量为1.0mL/min。使用光度检测器(波长为450nm)检测分离后的类胡萝卜素和叶绿素。样品进样体积为20L。在此条件下，叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、番茄

7、红素(lycopene)、-胡萝卜素和-胡萝卜素的保留时间分别为3.0、4.9、6.6、12.1、14.6和15.3min。取螺旋藻的培养液(通过测定光密度(560nm)得出培养液中螺旋藻干重于离心管中，离心后弃去溶液，加水洗涤后，加入2mL体积分数为90%丙酮水溶液，置于超声波发生器水浴上，使螺旋藻破碎。离心后取上层提取液用高效液相色谱法测定叶黄素/玉米黄质、-胡萝卜素及叶绿素a的含量，其最高含量分别为：1.65g/mg，2.15g/mg和21.4g/mg。 (4)、改良的高效色谱分析法。 采用美国Waters公司的680型自动程序梯度控制器，501型高压液相泵，M-490型可编程序紫外可见

8、光检测器，730型数据处理器，记录保留时间和峰面积，走纸速度为2cm/min。选择最佳的色谱分离条件是色谱分析中的关键，本方法选用两种流动相A液和B液，采用线性梯度洗脱分离色素组分。用改良的高效色谱分析法分析叶黄素循环组分，具有快速、准确、分离度好以及重复稳定等优点。 （5）、玉米黄浆水中提取玉米黄色素。 选用己烷质量分数高达74%80%的抽提溶剂油，根据液一固萃取原理，通过液固二相存在浓度差时的分子扩散作用，利用泵循环施以外力时的对流扩散作用，达到色素浸出的目的。再通过真空浓缩精制获得液态色素产品，或者添加辅料获得固态色素产品。 （6）、大豆中叶黄素的解析。 在酸和碱性稻壳灰中大豆油色素(叶

9、黄素)解析时，连续的异丙醇/己烷的洗涤，增加溶液极性可提高叶黄素的解析，表明竞争吸附很大程度上决定于溶液的极性。但是当加入2%异丙醇洗涤时，用多种提取法解析出来的叶黄素会减少。叶黄素吸附的量越多必然伴随着更多的叶黄素的解析。这说明酸性环境比碱性环境更有利于解析。 7、叶黄素产品生产工艺。 以万寿菊花中用正己烷萃取而得的叶黄素为例： 皂化时氢氧化钠水溶液w(NaOH)=0.17。 万寿菊(Marigold)是提炼叶黄素及类胡萝卜素的主要原料，其中黄色色素含量平均每公斤不低于12克，这种色素是无公害的天然色素。1.4 叶黄素化合物的药理作用叶黄素是一种重要的抗氧化剂，为类胡萝卜素家族（一组植物中发

10、现的天然的脂溶性色素）的一员，又名“植物黄体素”，在自然界中与玉米黄素共同存在。 （1）视网膜的主要色素成分：叶黄素与玉米黄素构成了蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分，也是人眼视网膜黄斑区域*的主要色素。人类的眼睛含有高量的叶黄素，这种元素是人体无法制造的，必须靠摄入叶黄素来补充，若缺乏这种元素，眼睛就会失明。 （2）保护眼睛不受光线损害，延缓眼睛的老化及防止病变：太阳光中的紫外线及蓝光进入眼睛会产生大量自由基，导致白内障，黄斑区退化，甚至癌症。紫外线一般能被眼角膜及晶状体过滤掉，但蓝光却可穿透眼球直达视网膜及黄斑，黄斑中的叶黄素则能过滤掉蓝光，避免蓝光对眼睛的损害。黄斑区的脂肪外层特别容易

11、受到太阳光的氧化伤害，因此这个区域极易发生退化。 （3）抗氧化，有助于预防机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤疾病F. Granado 等人研究了含有叶黄素的降糖药物对I 型糖尿病患的疗效, 患者服药21 天后, 利用HPLC 考察了叶黄素的生物降解率。研究表明, 叶黄素对I 型糖尿病患者可以有效地降低血糖,并且还有扩张血管的作用。另有研究表明, 易被人体胃与小肠吸收的叶黄素, 因其具有抗氧化性, 能通过免疫调节使细胞间通讯而发挥其抗癌作用。除此之外, 叶黄素还有防止由细胞衰老及机体衰老引发的冠心病, 心血管硬化等疾病, 从而提高人体免疫力。 （4）保护视力：叶黄素作为抗氧化剂和光保护作用，

12、可促进视网膜细胞中视紫质（Rhodopsin）的再生成，可预防重度近视及视网膜剥离，并可增进视力、保护视力。特别适合学生、司机等人食用。 （5）缓解视疲劳症状；(视物模糊、眼干涩、眼胀、眼痛、畏光等) （6）提高黄斑色素密度，保护黄斑，促进黄斑发育； （7）预防黄斑变性及视网膜色素变性； （8）减少玻璃膜疣的产生，预防AMD的发生，AMD是一种老年眼科退化性疾病，特别在欧美。一般容易发生在4JO岁以上人群。其发病因素，据褐斑病变团体调查分析，除了年龄和遗传因素外，和食物中抗氧化剂的摄入量、太阳光刺激、吸烟、性别等均有关系。而叶黄素和玉米黄素，是眼斑点色素的重要构成，存在于色斑的中间，它的功能，

13、好像是太阳高能蓝光的过滤器，从而保护了眼部的视网膜的被损害；同时又是视网膜的抗氧化剂，以保护眼球细胞的被氧化损伤。由于叶黄素不能为人体自身合成，只能从食物中摄取，因此注意经常补充叶黄素类食物，对防治AMD十分重要。2 实验部分2.1 目的要求2.1.1.用乙醇提取后，再通过氧化铝柱层析，经过正己烷洗脱得到纯品叶黄素。2.1.2.并用紫外光谱扫描得到紫外光谱图以确定叶黄素。2.1.3.通过用乙醇提取叶黄素的实验，要求掌握天然产物提取的基本操作技能2.1.4通过紫外吸收光谱表征叶黄素的最大吸收，要求理解紫外吸收光谱用途。2.2 实验原理叶黄素(3, 3-二羟基-胡萝卜素) 是一种萜，为胡萝卜素的氧

14、化物，又名“植物黄体素”3，分子式：C40H56O2，分子量：568.854，熔点为190 。叶黄素的极性很小不溶于水，而溶于某些有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷、正己烷等，呈黄色。它具有3个手性中心、故有8种立体异构体，叶黄素分子有一条含40个碳原子的长链，其中有多个共轭双键，正是这些共轭双键使叶黄素具有鲜明的颜色和抑制自由基的能力2。叶黄素结构如下： 叶黄素的结构L-叶黄素通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成5。叶黄素的极性较小，但分子中有羟基，可溶于乙醇，又可溶于正己烷，故用乙醇提取，再用正己烷洗脱，即可有效的除去杂质，又可得到纯品的叶黄素。美国国家健康协会眼科协会（NEI，The Nat

15、ional Eye Institute of the National Institutes of Health）已经证明，食用类胡萝卜素丰富的食品和降低老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)之间有明显的联系6。虽然，L-叶黄素的作用并不明确，但人们推测，L-叶黄素通过吸收蓝光，淬灭在光敏反应中产生的反应氧，进而避免了光线对感光细胞层的损害7。1994年，科学家研究了900位成年人的饮食习惯，目的就是发现ARMD和类胡萝卜素、维生素A, C及E的关系8。受试者中有几百人已经患有AMD，而对照组不患此病。结果表明，摄入高剂量类胡萝卜素的人群患A

16、MD的机率比摄入低剂量的人群要低43%。研究者发现菠菜和羽衣甘蓝作用（含有大量L-叶黄素）的保护尤其明显，他们确信，L-叶黄素和玉米黄质是降低AMD发病率的最基本物质。近些年来，我国也发明了叶黄素的新型提取工艺如高速逆流色谱法从万寿菊花粗提物中分离制备出高纯度单体L-叶黄素的方法9和从植物中提取L-叶黄素的方法10等，解决了L-叶黄素精加工问题，使L-叶黄素提取纯度达到98，使L-叶黄素产品在国内进行深度开发成为一种可能。每天使用100g 处理经UV-B照射的皮肤，发现皮肤的表皮层厚度增生减少了52，UV-B诱导表皮细胞的过度增生，这是UV-B皮炎的标志。研究还发现，吸烟者血浆、BMC及皮肤中

17、的类胡萝卜素的浓度远远低于非吸烟者的水平11。2.3 材料与仪器2.3.1 材料来源原料来自于校园内，以秋、冬落地银杏叶2.3.2 使用仪器和药品仪器： 常规的玻璃仪器、电热套、UV 2550紫外分光光度计 药品： 乙醇、正己烷、氧化铝2.4 叶黄素的提取与分离2.4.1. 提取：取50g黄色鲜银杏叶，用剪刀剪细，加入200ml 95%乙醇浸泡2小时，过滤，滤渣用95%乙醇再提取一次，普通蒸馏回收溶剂，得到膏状浓缩物为叶黄素的粗产品。2.4.2. 装柱：填装好色谱柱是柱色谱成功的关键，色谱柱要填的平整，中间没有气泡和空隙。将色谱柱固定在铁架上，柱身要和桌面垂直，（这样可形成较平整的柱面）将25

18、ml 95%乙醇倒入层析柱内，使溶剂流出的同时将称好的20g氧化铝通过干燥的小玻璃漏斗慢慢加入层析柱中而渐渐下沉，边加边用带橡皮管的玻璃轻轻敲打柱身，以排除空气，使填装均匀而无裂缝，加完氧化铝后，继续让溶剂流出，直到液面在氧化铝的顶部为0.51cm高度时，关闭下端活塞。在氧化铝表面上用圆形滤纸覆盖，以保持顶部平整，不受所加溶剂的干扰而产生不规则的色带。2.4.3. 加样：待色谱柱中液面离氧化铝表面约1 mm时，加入2ml 浓缩液（活塞打开），当样品液面离氧化铝顶部约1mm时，用少量的正己烷洗涤柱壁上的样品物质，洗净为止（液体为无色）。2.4.4. 洗脱分离：在柱子内加入正己烷溶剂（溶剂高度约1

19、2cm）层析开始进行，柱下用小烧杯接收流出液，待黄色液体流出时，用干净干燥的锥形瓶接收得约2030ml 即可，得到纯叶黄素。2.4.5 实验结果：（产品外观）纯品叶黄素为黄色粉末状，由于能溶于正己烷溶剂中，故我们得到的是用正己烷洗脱的黄色溶解液。2.5. 紫外光谱表征 将洗脱得到的溶液进行紫外可见分光光度计扫描，正己烷溶液中叶黄素的最大吸收波长为 444.00。3. 结果与讨论用95%乙醇提取得到的叶黄素粗品，再经浓缩后得到粘性的膏状物，是因为许多亲脂性和亲水性的成分都均可用于乙醇中，故而得到的成分较为复杂，混合物成粘性的膏状物，由于叶黄素为亲脂性成分，在正己烷中溶解度大，因此采用氧化铝层析柱

20、分离，使某些杂质被氧化铝所吸附，用正己烷为洗脱液将叶黄素洗脱下来，除去杂质，得到纯品叶黄素。通过乙醇提取，氧化铝层析柱的分离可达到良好的纯化效果，所以此方法是可行的。叶黄素产品可用于保健品及药品应用。4. 实验后感想这次的实验让我觉得很有意义，步骤都贴近生活。我们可以从中学到的知识与难度成正比,使我受益匪浅。校园里的银杏树下都是落叶，但是并不是所有的叶子都可以，必须是全部变黄的银杏叶。这样提取的银杏叶才能提取出叫纯正的叶黄素。在处理银杏叶时，大家人手一把剪刀，将黄色的叶子剪得很碎，是溶液与叶子充分接触。做实验的时候老师也一直陪在我们的身边，方便讲解和交流。让我们的使用做得很成功。经过这次的实验

21、，我们整体对各个方面都得到了不少的提高，例如团队精神、交流能力、独立思考、信息的捕获能力等；提高了自己动手能力，培养理论联系实际的作风，增强创新意识。希望下次的实验能做得更好，能够让我们得到更好的锻炼。参考文献1 于晓丽. 叶黄素产品研究J. 内蒙古石油化工, 2005(5):2-3.2Yeum KJ, Taylor A, Tang G, Russell RM. Measurement of carotenoids, retinoids, and tocopherols in human lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci , 1995, 36: 2756276

22、1.3 Annette L，Tobias G，Guangwen TBioavailability of lutein in humans from intrinsically labeled vegetable determined by LC-APCI-MS JJournal of Nutritional Biochemistry, 2003， 14(11):663-6704惠伯棣. 类胡萝卜素化学及生物化学M . 北京: 中国轻工业出版社, 2005, (1) : 248 258.5 陶俊, 张上隆，徐昌杰，安新民，张良诚. 类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程.  生物工程学报, 2002, 18(3):276-281.6 Bone RA, Landrum JT, Guerra LH, Ruiz CA. Lutein and zeaxanthin dietary supplements raise macular pigment density