基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术

1、精选优质文档-倾情为你奉上基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术 摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑。该系统在crRNA的指导下，使核酸酶Cas识别并降解外源DNA，其中，型CRISPR-Cas系统最为简单，仅

2、包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA ：crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术的核心为将tracrRNA ： crRNA设计为引导RNA，在引导RNA的指导下Cas9定位于特定的DNA序列上，进行DNA双链的切割，实现基因组的定向编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点 InDel 突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。关键词: CRISPR-Cas9系统；基因组编辑技术；核酸内切酶简介近年来

3、，基因组编辑技术(genome engineering technologies)的快速发展为生物学研究带来了新纪元。与传统的基因克隆技术不同，基因组编辑技术可直接在基因组上进行序列的敲除、插 入、定点突变以及组合编辑等，实现基因功能与调控元件的系统研究，在工业生物工程等方面具有广阔的应用前景。早期，基因组编辑技术主要利用同源重组介导的打靶技术，但由于效率较低 (1010)，极大地限制了其应用。为解决这一难题，一系列人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术被开发，可通过在基因组特定位置上形成DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB)，借助于细胞自身的修复系统如非同源末端

4、连接（non-homologous end joining, NHRJ）或同源重组（homology directed repair，HDR），从而实现在不同生物与细胞类型中有效的定点基因组编辑。目前，已有种不同的人工核酸内切酶应用于基因组编辑:巨核酶技术(Meganucleases)、锌指核酸内切酶 (zinc finger endonuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，ZFN）与RNA 靶向DNA内切酶Cas9。1CRISPR 研究历史1987 年，日本课题组在 K12 大肠杆菌

5、的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列2，随后的 研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细 菌的基因组中，2002 年，科学家将其正式命名为 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)3-5因为缺乏病毒和质粒的序列信息，初期对 CRISPR 的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明2005 年，三个研究小组均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。2006 年，美国研究小组通过生物信息分析预测， C

6、RISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式行使其免疫功能6但这些都只是假设2007 年， Barrangou 等 7首次发现并证明细菌可能利用 CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵2008 年 ， Marraffini 等8又发现细菌 CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能，由此科学家们揭开了研究 CRISPR 系统作用机制的序幕。之后研究人员很快发现 CRISPR 系统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为研究的热点。9CRISPR-Cas9系统的作用机制Crispr/cas系统是很多细菌和古生菌的一种获得性免疫系统，在已经完成测序的细

7、菌中占40%古生菌中占90%，它通过CRISPR对入侵的外源核酸分子或者病毒进行特异性地识别并用 CAS 蛋白对其切割消化，从而达到对自身的免疫性保护。CRISPR是一段特殊的 DNA 重复序列，长度通常为 2147 个碱基，可变的间隔序列为 2672 个碱基。Cas存在于 CRISPR 位点附近，是一种双链 DNA 核酸酶。它与 folk 酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。在细菌和古生菌中 Crispr/cas 系统主要分为三种类型，根据核心元件和序列的不同又分为约 10 种亚型。菌体通过摄取，表达以及干涉三个基本过程发挥免疫过程。简单地说就是病毒或核酸分子入侵细菌，细菌将其

8、编辑插入到自身的基因组 CRISPR 位点附近，在转录表达阶段，CRISPR 间隔重复序列被转录成不成熟的前体 crRNA(pre-crRNAs)。pre-crRNAs 被进一步剪接加工形成成熟的小的 crRNAs， 有一段间隔序列两边被重复序列包围。在干涉阶段，crRNA 和 CAS 蛋白结合形成 一个大的效应复合物，当病毒或核酸再次入侵时，crRNAs 就会通过碱基配对将 CAS蛋白带到互补区，诱导基因发生位点特异性的断裂，从而阻断了病毒在细胞内的扩增。在不同类型的 Crispr/cas 系统中，效应核蛋白体（RNP）的组装和功能不同，I 型系统中 crRNAs 被组装到一个称为 Casc

9、ade的复合物中，由 CAS3 引起 DNA 双链断裂。三型系统中 RNP 复合物中包括 Cas RAMP(Cmr 或者 Csm) 蛋白，在体外 crRNAs 识别和切割合成的 RNA，也可在体内切割双链 DNA。现在应用最广的是 II 型 Crispr/cas 系统，它的组装简单仅仅需要一个 Cas9 核酶。最近 Cas9 和 sgRNA 组成的复合物的晶体结 构已经被解析出来，其造成 DNA 双链断裂的机制进一步得到证实。CRISPR-Cas9系统工作原理模式图最近 Mali et al.改造了酿脓链球菌 II 型 Crispr/cas 系统称之为 Crispr/cas9 系统， 该系统由

10、gRNA 和人类编码子最优的 Cas9 核酶形成 RNA 和 Cas9 蛋白的复合物，在应用中我们将靶序列插入到 Crispr 位点中，它被进一步转录加工形成 sgRNA， sgRNA识别并结合靶位点将Cas9蛋白带到PAM位点上游的DNA片段上，由Cas9 蛋白的两个亚基分别切割互补链和非互补链，引起双链断裂。CRISPR/Cas9 系统可通过简单的转染技术将其转进各种不同的细胞系中从而改造不同的细胞。其应用简单便捷，易于操作，成为一种强大的基因修饰工具7。Crispr-cas9 系统的应用展望 和TALEN 和 ZFN 相比，Crispr-cas9 系统有很多优点也有一些缺点。和 TALE

11、N 和 ZFNs 不同，Crispr/cas9 系统是利用碱基配对来识别靶点，而 Cas9 核酶是一致的，因此只需要设计出靶基因的 gRNA 就可以了。因此 Crispr-cas9系统的设计简单便捷，易于筛选。Crispr-cas9 系统的应用也更加广泛，它可用于各种细胞还可同时靶向多个基因或者同一基因的不同位点。而且通过突变 Cas9 的一个酶切活性位点可以提高细胞的同源重组率，提高 target in 效率。如果将 Cas9 的酶切活性位点全部缺失突变， 融合表达 cas9 和某些转录因子，可以诱导或抑制靶基因的转录表达，该技术被称 为 CRISPR 干扰技术(CRISPRi)。衡量一项技

12、术的研究应用前景时，效率和脱靶率是一项重要指标，在已发表的应用Crispr-cas9系统的文献中，Crispr-cas9系统和ZFN以及TALEN的效率相近， 但是 Cas9 对碱基错配有很大的包容性，造成了该系统的高脱靶率。由于该技术研究发展的时间还比较短，进一步的研究很可能会提高它的打靶效率降低其脱靶效率。在接下来的研究中该系统的转运载体的研究也会进一步提高其应用。10-11参考文献1 Capercchi M R. Altering the genome by homologous recombination J. Science,1989,244(4910)：1288-1292.2 Is

13、hino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429-5433.3 Jansen R, van Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of a nove

14、l family of sequence repeats among prokaryotes. Omics: a Journal of Integrative Biology, 2002, 6(1): 23-33. 4 Mojica F J, Ferrer C, Juez G, et al. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be inv

15、olved in replicon partitioning. Mol Microbiol, 1995, 17(1): 85-93. 5 Jansen R, Embden J D, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-1575 .6 Makarova K S, Grishin N V, Shabalina S A, et al. A putative RNA-interfere

16、nce-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct, 2006, 1: 7. 7 Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.8 Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science, 2008, 322(5909