细胞常见污染情况分析

1、细胞培养常见污染的判别及应对措施 2011-01-02 10:19:04| 分类： 实验 | 标签：污染 无菌 细胞 培养基 灭菌 |字号大中小 订阅 一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免 的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，

2、吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。24小时就满视野都是

3、了。污染源大多数情况下是培养用血清。图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，10倍）图2 支原体污染的光镜检测（20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。培养液澄清。低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问

4、题。既然已经污染了，就全部更换你的器皿。培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。3.霉菌污染比较常见的一种污染，常常来源于污染的空气、水和器械。图10 霉菌污染的光镜检测（低倍）图11 霉菌污染的光镜检测（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400倍）图12 霉菌污染的光镜检测（树枝状，高倍）图13 霉菌污染的倒置显微镜检测（树枝状）4. 杆菌污染：培养基中加入抗生素可以减少此种污染，但也不是绝对的。图14 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，高倍）图15 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，低倍）细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有

5、许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次

6、数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的

7、FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！很可能是超净台无效了，或者培养基？ 其实严格操作箱污染都难我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染，新传的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？都污染了，我仍还来不及，那还敢换新瓶染菌有很多原

8、因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。消毒用新洁尔灭好象不是太有用。人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火的附近操作，污染的几率是很小的。从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。求助！关于细胞培养中的真菌污染！感激！先谢谢大家的帮助！现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！细胞的形态看起来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！加大

9、量的抗生素没有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！谢谢大家的帮助！杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。同时该注意如何防止污染。我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免得引起培养箱中的大规摸污染。在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。这可能是不规范操作引起的，安全起见还是将细胞室全面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！谢谢大家的帮助

10、，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！现在就是不能确定是不是污染。我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！现在确实是问题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？若培养基不混浊，可能真的是细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？只要将污染的扔掉就行，没必要都扔掉！两性霉素！sigma在华美有分装！但是浓度很小，关键还是环境问题！黑白圆点在100倍显微镜下有多大，是不是酵母菌小黑点和小白点是在200倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的1

11、/5到1/4左右！细胞状态不好是因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！另外问一下sleevexz，酵母菌是什么样的，怎么鉴别！还有一个问题就是，实验室用的双抗是从Gibco公司买过来的直接使用的液体，具体规格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求储存在20 C，但是有效期只到2002年9月，现在都已经差不多过期半年了，但是实验室的老师都说没有问题，可以用，现在大家就都是一直用这样的抗生素在！你们说会不会是抗生素的问题的！养细胞经常无缘无辜的染菌？烦烦烦！我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一

12、段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。现在都有点神经质了，请各位指点你这个问题说大不大，说小也不小。说不大呢，七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中

13、途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多，具体的你再问吧。最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。还有，你们的紫外灯没有问题吧？非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指

14、点。戴手套试试巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌

15、，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。操作是导致污染的最主要原因根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作

16、服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。操作时，滴管两头都要烧。还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），但要小心浓度太

17、高细胞也会死亡。对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。如果不幸染上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。灭菌操作：在无菌箱内每立方米用甲醛810毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种在无菌箱中每立方米用甲醛810毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶二级种接3040袋为宜。（一）常用消毒剂 现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：1 35甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。用于培养室、无菌室的灭菌。 20.1的升汞水（HgCL3）：能使蛋白质变性，抑制酶类。0.1升汞配制方法是称取升汞0.1克，

18、用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于无菌箱、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。 3石炭酸（C6H5OH），5浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于 工作服、实验桌的灭菌。杀菌效果同升汞。 4高锰酸钾（KMnO4）：氧化剂。0.1浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死 杂菌。 5乙醇（CH3CH3OH）：又称酒精。消毒以75浓度的效果最好。它能使蛋白质脱水变性。高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。 6新洁尔灭：0.25新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。一般新洁尔灭5原液50毫升；加水950毫升配成。 7

19、漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前临时配制，静置12小时，取上清液喷射，进 行室内消毒，每平方米用1升。 8药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。 92硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。用于床架、木架等各种菌种架的消 毒。还可用5硫酸铜溶液。 100.5波尔多液：先用硫酸铜1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起来即成。用于菌种架、段木的消毒。 11.多菌灵：用于杀灭真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍喷洒均可。 （二）无菌箱及无菌室的消毒灭菌 无菌箱的消毒灭菌，可采

20、取以下几种方法： l用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸2030分钟即可。 20.1升汞水消毒：用0.1升汞水浸过的纱布或海绵进行指擦，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。喷雾后 2030分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。 3紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管；每次开2030分钟，就能达到空间杀菌的 目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌

21、效果。 4石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。 5石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。实践证明，这样做效果很好。 无菌室消毒同无菌箱。 （三）无菌室的使用规程 无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程： 1接种室内和缓冲室内使用前，用5石炭酸溶液喷雾。把所需要的器材搬入缓冲室清洗，等晒干后搬入接种 室，打开紫外线灯，照射杀菌。 2穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分钟。进人接种室后，查验器械是否放在一定位置。然后用 5石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。然后退回缓冲室。还可给接种室门口地面洒一层