植物DNA和RNA提取方法

1、实验一植物基因组DNA勺提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide,简称为CTAB）十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简

2、称SDS筹离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA冰溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2%CTAB抽提缓冲溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（0.5MEDTA8ml,先用70mlddH2O溶解，再定容至200ml灭菌,冷却后%2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再

3、加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1.DNA的提取（1）2%CTABJ由提缓冲液在65C水浴中预热。（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（ 3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（ 4） 将磨碎液分倒入ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之）（ 5） 置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；（ 6） 却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡23min，使两者混合均匀；（ 7） 入离心机中10000rpm离心10min,与此同时，将6004的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（ 8） 000rpm离心1

4、min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；（ 9） 10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（ 10） 60sec后，直立离心管，加入720以的75%乙醇及804l5M勺醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（ 11） 置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；（ 12） 10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入80075%的乙醇，将DNA再洗30min;（ 13） 10000rpm离心30sec后

5、，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（ 14） 入50小XTE合RNase獴冲液，使DNA溶解，置于37恒温箱约15h,使RNA消解；（ 15） 于-20保存、备用。2.DNA质量检测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、注意事项（ 1）叶片磨得越细越好。（ 2）移液器的使用。（ 3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,ED

6、TA2提取基因组DNA的方法有哪些各有何优缺点实验二多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)®因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测1 实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。2 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。3 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。4 退火：在

7、体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA,即退火阶段。5 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的

8、DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。漠化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧

9、光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。三、实验材料及相关试剂基因组DNA,基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2. PCR操彳(在冰上操作)：(1) PCR反应混合液的配制：反应体系25以牵无菌的mL离心管中按下列操作程序加样：反应物加样体积/以L终浓度顺序ddH2O110 x Buffer225 mmol/L 3MgCl210 mmol/L 4nn1 xn mmol/Ln200dNTP10tiM上游引物10以M下游引物DNATaq聚合酶m mol/LN mol/LN mol/L1 U(2)将反应混合

10、液混匀,然后每个PCR管中分装24反应混合，再加1蟆板DNA,最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发，然后稍离心。(3)将PCR管放到PCR热循环仪中,按下列程序开始循环：94c4min1（预变性）I94b30sec,60c30sec,72c2min72c7min35个循环(4)注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c.每加一种反应物，应换新的枪头。3.PCR产物的检测：琼脂糖浓度（）;EB浓度（5以l/100mlTBE）（1）制胶（以15

11、0mL为例）a. 称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液（pH）,摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50），倒入其中，直至厚度为46mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约3045min）；d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。（2）点样a.将“澳酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；b.每孔点样从J蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。（ 3）电泳打开电源开关，调节电压至35V/cm（约100V）,可见到浪酚蓝条带由负极向

12、正极移动，约1小时后即可观察。（ 4）染色将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。（ 5）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（ 6）注意事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c. 倒胶注意厚度（4-6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以

13、加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1 .PCR反应液中主要成分是哪些在PCR反应过程中各起什么作用2 .为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化3 .用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项实验三植物总RNA的提取一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA,必须最大限度地抑制提取过程中内源性

14、及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方（一）仪器1 低温离心机2 分光光度计3 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜，之后再用DEPCK浸泡冲洗。4 高压灭菌锅5 研钵、剪刀、一次性手套等(2) 药品1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠(NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8

15、. 乙醇9. 乙二胺四乙酸(EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇(3) 试剂配方1. %DEPCK0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2. 2mol/LNaAc、mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3. 5XMOPS电泳缓冲液（pHMOPSmol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L四、实验步骤（一）总RNA的提取（方案一）1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10mL离心管。加入4mol/L异硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol/LNaAc

16、（pHmL氯仿mL混匀，冰浴放置30min。2. 4，8000r/min，离心13min。3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。4. 加入2倍体积无水乙醇，-70，h。5. 4，8000r/min，离心13min。6. 弃上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl,使其溶解。7. 移入mL离心管中，冰浴2h。8. 4，13000r/min，离心15min。9. 弃上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混匀。10. 4，13000r/min，离心6min。11. 取上清,并加入1/10体积3mol/LNaAc（pH），2倍体积无水乙醇，-20放置30min。12.

17、 4，13000r/min，离心20min。13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。15.加30uLDEPCC溶解，-70C保存。（二）总RNA的提取（方案二）利用TRIzol提取液抽提RNA,具体步骤如下：1. 取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的ml离心管；2. 加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；3. 室温放置5min后，加入ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min；4. 在8条件下，12000rpm离心15min；5. 溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入ml异丙醇在1530条件下，沉淀10min；6. 然后在

18、,28条件下，12000rpm离心10min,RNA沉淀管壁和底部；7. 去掉液体部分，加入1ml75%酒精洗2次；8.风干后，加入25dDEPC处理过的水溶解RNA,储藏于-80C冰箱备用。(三)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA1配制%变性琼脂糖凝胶(40mL)称取0.48g,力口入DEPC/KmL,5X电泳缓冲液4mL,加热使溶解，稍冷却加入甲醛mL,混匀，室温凝固h.2. RNA电泳检测样品制备RNA2以1甲醛以1甲酰胺110XMOPS2ii1RNALoading21Buffer灭菌的DEPC4以1水混合液轻轻混匀并离心，放于65下温育5min后，置于冰上。3. 电泳检测将%变性琼脂糖

19、凝胶放入水平电泳槽中，加1XMOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5V/cm条件下电泳30min，然后在EB中染色15-20min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。五、注意事项1 在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2 RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。思考题：1.实验中所用到的各试剂的作用是什么焦碳酸二乙酯(DEPC),吗啉代丙烷磺酸(MOPS),异硫氰酸胍,醋酸钠(NaAc),氯仿,苯酚,甲醛,乙醇,乙二胺四乙酸（EDTA）,异丙醇动植物组织mRNA提取

20、实验方法一、材料水稻叶片或小鼠肝组织。二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（1802小时）装蒸馏水，然后加入的DEPC（体积/体积）,处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPCi理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、1渥析柱加样缓冲液；20mmol/LTrisCl；LNaCl1mmol/LEDTA,%SDS4、洗脱缓冲液：10mmol/LTrisCl,1mmol/L EDTA% SDS。四、操作步骤(一)动植物总RNA提取-Trizol

21、法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，1

22、2000g离心10分钟。4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。(二)mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维

23、素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸储水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。1、用LNaOH悬浮-1.0goligo(dT)纤维2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于。4、将（一）中提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x

24、层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。7、 加入1/10体积的3MNaAc，倍体积的冰冷乙醇，混匀，-2030分钟。8、 4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4下12000g离心5分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。10、 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70)。注意1、mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。2、oligo(dT)纤维

25、素柱用后可用lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入叠氮钠(NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。RNA提取流程RNA(totalRNA)和信使RNA(mRNA用抽提RNA的提取RNA和无RNA酶的环境原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA,信使RNA(mRNA)核糖体RNA(rRNA),转运RNA(tRNA)而真核生物则能产生四种，还有一种为真核生物所持有的小是由基因转录而来的，它运送编码蛋白所需的信息.由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要.应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RN

26、A存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步，也是关键的一步.提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA)也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用，它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量或用于RNA的生化研究，处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏同此建立一个无

27、RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.方案:工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.如有可能，使用标有"无RNA酶”的商品试管，吸头，溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,3）双蒸水（ddH2O）和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC焦碳酸二乙酯）进行处理：每100mL溶液或水中加入DEPO液，放在摇床上充分混匀并在37c下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.4）

28、用分子级的试剂和DEPC&理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.5）分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300C烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.从组织中提取RNA则要注意：动物器官的解剖器械存放组织块的玻璃器皿冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.分离后的RNA通过琼脂

29、糖凝胶电泳再经澳化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA（18s和28s）条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.一步法分离RNA应用从组织或细胞中分离细胞的总RNA从液体样品中分离RNATRIREAGENT（Tripure双一种用于RNA分离的商品溶液.该法源于chomc-zynski的RNA分离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品，我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时分离RNA,DNA蛋白质.方案.用lmLTripure/50-100mg（组织）匀浆组织样品.对于细胞，每10cm2面积（贴壁的单层细胞）或每106个细胞（细胞沉淀）使用1mL.将样品转至

30、管中.（-70C可保存1月）室温下放置样品5min.每1mLTripure中加入氯仿并摇动15s,置于室温下215min.4C下12000g离心15min.将水相（上部）转至一个新EP管.每1mLTripure加入异丙醇沉淀RNA.将样品置于室温下510min.4C,12000g离心10min.凝胶样沉淀物为RNA.吸出上清并用1mL75*醇在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次，4C,7500g离心5min.晾干RNA沉淀.然后用无RNA酶的水，甲酰胺或的SDS容液溶解沉淀.RNA的检测:将样品稀释液于三处波长处读取OD值.记录OD值,通过计算确定RNA浓度或纯度.公式如下对于ssDNA:ssDN

31、A=33X(OD26&OD310)湍释倍数对于dsDNA:dsDNA=50X(OD260-OD310)稀释倍数对于ssRNA:ssRNA=40X(OD260OD310)xffi释倍数以上浓度单位为ug/mL.注意事项1)OD310值是背景，若盐浓度较高，OD310"值也高.2)OD260/OD280对DNA而言其值大约为，高于有RNA污染.低于则有蛋白质污染.3)OD260/OD280对RNA而言其值大约为.小结所有可能与RNA接触的器材均得用DEPCM理.操作过程中应带口罩,手套.DEPC致癌之可能，尽量避免接触皮肤提取的RNA应尽早逆转录成cDNA.逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)RTPCR间接用来扩增从RNA分子今得到的一段特异序列.RNA首先被逆转录为cDNA.用位于一段特异序列或者一