植物中SOD分离提取及性质研究

1、百度文库-让每个人平等地提升自我植物中SOD的分离提取及性质研究前言：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase简称SOD,是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专屋一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基(对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用)，具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中

2、，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。材料及方法：一、试剂(1) l磷酸盐缓冲溶液/(2) 50mmol/lTris-HCL(3) mol/L蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液：准确称取L-蛋氨酸(GHiNOS,MW=0.3879g于100mL小烧杯中，用少量mol/L的磷酸钠缓冲液溶解后，移入，100mL容量瓶中并用mol/L的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀(现用现配)。4c冰箱中保存可用12d。(4) X104mol/LNBT溶液：准确称取NBT(COHOCLNoQ,MW/=0.1533g于100mL/J、烧

3、杯中，用少量蒸储水溶解后，移入、250mL容量瓶中用蒸储水定容至刻度，充分混匀(现配现用)。4c冰箱中保存可用23d。(5)含wmol/LEDTA的2X105mol/L核黄素溶液：A液：准确称取EDTA(MW=2920.00292g于50mL/J、烧杯中，用少量蒸储水溶解。B液：准确称取核黄素(MW=0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸储水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸储水定容至刻度，此溶液为含LEDTA的2mmol/L核黄素溶液。4c冰箱中保存了可用810d。%该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4c冰箱中保存。当测定SODB活时，将C液稀释

4、100倍，即为含wmol/LEDTA的2x105mol/L核黄素溶液。/(6) mol/L磷酸钠缓冲液取mol/L的磷酸钠缓冲液50mL移入100mL容量瓶中用蒸储水定容至刻度，充分混匀。4C冰箱中保存备用。(7) 50mmo邻苯三氛：称取邻苯三氛0.063g,用10mmol/lHCL溶液溶解，定容至-10ml,避光保存'附录IIzpHLNa2HPO4LNaH2PO4附录IITris-HCl缓冲溶液(LTris溶液和XmLLHCl混匀后，加水稀释到100mL)pHX/mL/PHX/mLPHX/mL2 .实验仪器移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管

5、、'分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴梢、电泳梢、电泳仪、培养皿、日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等3 .实验内容(1)大蒜粗酶液的提取I.提取：称20g左右的大蒜至于研钵（事先冷藏）中，充分研磨使细胞破碎，再加入5mll的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏），继续淹没搅拌15min,使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min,离心10min,弃去沉淀，得提取液。H.取出杂蛋白：提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min,5000r/min离心10min,取出杂蛋白，得粗酶液。田.沉淀SOD:将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，5000r/min离心1

6、0min,得SOD沉淀溶于2ml的磷酸盐缓冲溶液中。IV.热击处理：把提抽原液注入已编号的试管然后将试管置入恒温水梢，温度设置为60C,热击20min。高速离心去杂取上层清液。稀释5倍，待用。（2）SOD性质的研究I.酶活力的测定（NBT法）/每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL其中48号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25C,光强为4500Lux的光照箱内（安装有3

7、根20W勺日光灯管）照光15min,然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100%,根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50%抑制率的酶液量（wL）作为一个酶活力单位（U）。表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mD磷酸酸（Met）NBT溶酶钠缓冲液磷酸钠缓液素溶液冲液145678n.影响sod样液活性的因素不同PH对酶活力的影响：首先取6支试管按下表加入试剂式管试Rm&l

8、t;123456SOD酶液磷酸缓冲液(PH蒸储水22222/2、在最适温度卜，水浴10min,取出邻苯三酚吸光值加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min,加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。不同温度对酶活力的影响：首先取5支试管按下表加入试剂、£管L/试剂ml，、1号2号3号4号5号温度处理0255075100磷酸缓冲液33333SO珊液蒸储水22222在各自的温度卜静置10min,然后取出邻苯三酚吸光值加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min,加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。抑制剂的影响:按下表4支试管加入试剂试管试剂mL1234%H2O215仙1/

9、20回25uL30ulSO珊液于30c水浴恒温30min,取出迅速冷却至25c邻苯三酚吸光值/'加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min,加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。(3) PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型I.配胶 .分离胶：试剂名称用里/ml30%ACR/Bis8pH50mmol/LTris-HCl510%SDS10%过硫酸钱蒸储水TEMED.浓缩胶贮液100mL溶液中含量PH凝胶的配置E核更系4mgB1MHCl48ml/Tris5.9g%浓缩胶T=%TEMEDB:D:E:F=1:3:1:3DAcr10gBis2.5gF蔗糖40g.电极缓冲溶液溶剂名称100m

10、L溶液中含量PH配置电极缓冲液Tris6g用时稀释10倍甘氨酸28.8g蒸储水1Ln.操作.制胶按配方在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。凝胶在30-40C放置约40分钟-1小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在30-40C,聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚） .加样按下表加入试剂，充分振荡

11、，使醇液与变性剂均匀混合。、（Mn-SOD的活性受氯仿-乙醇的影响，Cu-Zn-SOD和Fe-SOD这两种同工酶均对H2O2酶感，Cu-SOD对KCN酶感，Mn-SOD不受CN的影响）、编号试齐IJ'、123粗酶液/ul20/202040%蔗糖溶液/ul202020（含澳酚蓝）氯仿-乙醇/ul-二7-30%H2O2/ul-7蒸储水/7-待各管溶液配置好后，分别取10ul加入凝胶的3个齿上 .电泳SOD同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳连接电源，调节电流至15mA,带样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA,当染料前言距离凝胶边缘1-2cm时，关闭电源，电泳结束。 .染色SOD活性染色取凝胶板，采用SOD负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色：i. 在x10-3mol/l氮蓝四噪（NBT）黑暗下浸泡20分钟；/ii. 在x10-2mol/l磷酸钠缓冲溶液（含x10-2mol/lTEMED、x10-5mol/l核黄素），中，在黑暗条件下浸泡15min./xi0-2mol/L磷酸钠