植物组织培养的一些注意事项

1、1 / 26植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括 MS、 LS、BL、BM、ER 等培养基。其中 MS 培养基应用最广泛，其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高，微 量元素种类齐全 , 其养分数量及比例均比较合适 , 广泛用于植 物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。 LS、 BM、 ER 培养基 由 MS 培养基演变而来。2 、硝酸钾含量较高的培养基包括 B5 、 N6 、 LH、 GS 等培 养基。1B5 培养基 B5 培养基除含有较高的钾盐外，还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素 , 较适合南洋杉、 葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。2N6 培养基 N6 培养基

2、(朱至清等 1975 )系我国学者创造获国家发明二等奖 , 适用于单子叶植物花药培养 , 柑橘花药培 养也适合 , 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。3SH 培养基是 矿盐浓度较高的一种培养基，其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵( NH4 H2 PO4 ) 提供的 , 这种培养基适合于某些单子叶及 双子叶植物的培养。3 、中等无机盐含量的培养基1H 培养基本培养基大量元素约为 MS 培养基的一半，仅磷 酸二氢钾及氯化钙稍低 , 微量元素种类减少 , 而含量较 MS 为高 , 维生素种类比 MS2 / 26多。适于花药培养。2尼奇培养基 (Niotsch 1969 ) 此培养基与 H 培养基成分

3、基 本相同 , 仅生物素比 H 培养基高 10 倍。也适合于花药培养。3米勒培养基 (Miller 1963 ) 此培养基和 Blaydes(1966) 培养基二者成分完全相同。 适合大豆愈伤组织培养和花药等培养 用。4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。 有以下几 种:1改良怀特培养基 (White 1963 )2WS 培养基(Wolter & Skoog 1966)3克诺普液 ( Knop 1965 ) 花卉培养上用得多。4贝尔什劳特液 (Berthelot 1934)5HB 培养基(Holley & Baker 1963)此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养

4、中效果良好。 其成分是大量元素比 1/ 2 克诺普( Knop ) 液稍多 , 微量元素用贝尔什劳特液 , 每升培养基中加 0 . 5ml二、与培养基有关的一些细节问题1 培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP（三级）及分极纯 AR（二级）,以免杂质对培养物造成不利影响。2、调节 Ph 也可用精密 pH 试纸（应在干燥器中保存，以免吸湿3 / 26而失效） 。培养基过酸的可用 1mol/ L 氢氧化钠 （ NaOH） 来调节; 培养基过碱的可用 1mol/ L 盐酸（ HCl ） 来调节（ 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水 , 定容到 1 000ml

5、 即可。 1mol/ L HCl 的配制方法是量取 12mol/ L HCl 84ml ,加水定容至 1 000ml） 。经高压蒸汽灭菌后 , 由于某些成分的分解 （如蔗糖的分解 ） 或氧化 , 酸度会增加 （ pH 值一般可降低 0 .2 ） 。有时玻璃器皿质量较差 , 其中一部分物质溶解 , 也会影响 酸度的变化。这些在调整 pH 值时都要考虑进去。分装后应立即 灭菌, 若因故不能及时灭菌 , 最好放入冰箱中在 24h 内完成灭 菌工作。灭菌时压力表读数为 0 . 8kg/cm21 . 1kg/ cm, 121C时保持 15min20min 即可。3、某些生长调节物质 , 如吲哚乙酸、玉米

6、素及某些维生素 等物质遇热不稳定 , 因此不能进行高压灭菌 , 而需用过滤方法灭菌 , 经过滤灭菌的溶液 , 可在琼脂培养基温度下降到大约40C时加入到已高压灭菌的培养基中。4、配好的培养基可放到培养室中预培养 3d , 若没有污染反 应, 则证明是可靠的 , 可以使用。暂时不用的培养基最好置于 10C下保存，含有生长调节物质的培养基在 4C5C低温下保 存则更理想。 含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完 其他培养基至多也不能超过一个月。 一般情况4 / 26下 , 两周内应用完 以免干燥变质。三、培养材料及消毒1、 取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采 样, 生长末期或已

7、进入休眠期 , 则外植体对诱导反应迟钝或无 反应。2、 器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴 , 越向上的 部分所形成的器官其生长的时间越短 , 其生理年龄也越老 , 越 接近发育上的成熟 , 越易形成花器官。 反之, 越向下, 其生理年 龄越小。木本植物的组织培养中 , 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部 的萌条较好 , 下胚轴与具有 3 对 4 对真叶的嫩茎段 , 生长效 果也较好 。一般情况下 , 幼年组织比老年组织具有较高的形态 发生能力。3、材料大小的影响：材料越小成活率越低 , 茎尖培养存活 的临界大小应为一个茎尖分生组织带 1 个2 个叶原基，约 0 .2m m0 .3mm 大小。叶片

8、、花瓣等约为 5mrm,茎段则长约 0 .5mm。因此,除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好 , 外植体过大易造成污染 ,有实验 证明外植体越大污染率越高。4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染 , 夏季比冬季带 菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。 取材最好选在中午或 下午 , 避开阴雨天取5 / 26材可减少污染率。 消毒是为了消灭病菌 , 以 保证无菌组织培养的进行。 但不同植物及一株植物不同部位的组 织, 其带菌程度不同 , 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏 感度也不一样。 最初所使用的消毒剂种类 , 浓度及消毒时间的长 短都要进行摸索 , 以达到最

9、佳的消毒效果。材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温 - 80 , 对与难消毒 的根及地下部位材料 可将其浸入消毒液中进行抽气减压 , 以帮 助消毒液的渗入 , 从而达到彻底灭菌的目的。潘学峰等 ( 1998) 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1% 的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌 10min 的效果最好。四、材料的接种1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操 作和无菌培养技术 , 做好接种室的消毒是至关重要的。 污染的主 要来源是空气中的细菌和真菌孢子 , 因此 , 每次接种前应进行 地面的清洁卫生工作 , 并用 70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降 , 并 用紫外线灯照射 20min

10、。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒 精擦洗 , 并定期清洗过滤膜 , 以延长使用寿命。2、 无菌操作要求： 工作人员使用的工作服、 帽子、口罩等 , 要经常保持干净 , 并定期进行消毒 , 即将洗净、晾干的衣帽、 口 罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、 衣服、手指中都带有许多杂6 / 26菌 , 为此要穿上工作服 , 戴上帽子 , 也必须剪除指甲 , 并用肥皂擦洗 , 最好再在新洁尔灭溶液中浸 泡 10min , 接种操作前则用 70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产 生的污染 ,主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的 , 因此 , 在操作时应禁止谈 话并应戴上口罩。3、材料的分

11、离、切取和接种切割动作要快 , 防止挤压使材料受损伤而招致培养失败 , 也要避免使用生锈的刀片 , 以防止氧化现象产生。 接种时要防止 交叉污染的发生 ,刀和镊子等接种工具使用一次应放入 70% （ 或 95%）酒精中浸泡 , 然后灼烧放凉备用。接种时轻轻取下封口纸 , 动作要慢以免气流冲入瓶中造成 污染。将瓶口靠近酒精灯火焰 , 瓶口倾斜 , 以免空气中的微生物 落入瓶中 , 将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟 , 将灰尘杂物等固定在 原处 , 然后用镊子将外植体送入瓶中 , 材料在培养容器内的分 布要均匀 , 以保证必要的营养面积和光照条件。茎尖、 茎段等基 部插入固体培养基中 , 叶片通常将叶背

12、接触培养基 , 这是由于 叶背气孔多 , 利于吸收水分和养分的缘故。7 / 26五、材料的初代培养1、实验方案的设计1）、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的 实验方法 , 尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。2 ）、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定 的。正交设计是多因素分析的有力工具 , 它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平 , 因为它可以用较少的实 验次数得到较多的信息。 例如 , 一个 7 因素水平的实验 , 若将各 因素水平全部组合都做一遍 , 需要 27= 128 次, 而正交设计只 需做 8 次实验就可以了 , 虽然实验次数减少了

13、, 但因为各因素 水平搭配均匀 , 8 次实验基本代表了全部实验的情况。正交实验的设计 , 主要工具是正交表。 大多数生物统计学书 都列出了可供选择的正交表，如 L4( 23) , L8(27)见(表 2 - 11 , 表 2 - 12) 。字母 L 右下角号码 8 表示它有 8 个实验要做 , 括号 内的指数 7 表示这张表所安排的实验最多可考察 7 个因素(也可 安排 2 个6 个，超过 7 个要选择其他正交表)，底数 2 表示 被考察的因素只要求两个水平。 在进行实验前可根据要测试因素 的多少及每种因素所考察的水平 , 选择适合的正交表 , 然后按 表进行实验。 现举一个例子来说明 ,

14、设影响某种植物试管苗生长 的因素有光照时间、光照强度、pH 值、温度、蔗糖浓度、BA 浓度、 NAA 浓度 7 个因素, 每个因素选择两个水平 , 即, 光照时间 ( 10h , 14h ) 、光照强度 (1000lx , 2000lx )、 pH 值( 5 . 5 ,8 / 265.8 )、温度(20C, 25C)、BA 浓度(0.5,2.0 )、NAA 浓度( 0 . 5 ,1 . 0) 、蔗糖浓度 (2% , 4%) 。现根据因素和 水平的多少选择一个适合本实验的正交表，选 L8(27)最理想，填表时,因素水平对号入座,见表（2 -13 ）。第一号实验是光 照时间 10h/ d、光照强度

15、1000lx、pH 值 5.5、BA 浓度 2.0、NAA 浓度 0.5、蔗糖浓度 4% ,其他实验依次类推。根据 8 个实 验结果，如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等，综合考虑, 根据需要选取各最适培养条件。也可通过一定的计算方法（参考统计学书），算出极差（R）,极差（R）表示每个因素在实验中 所起作用的大小，R 越大表示该因素的不同水平对实验结果的 影响越大，但若没有可计算的指标时，还是选择单因子实验较 好。表2 - 11J（丹正交表123111122123122斗2219 / 26表2 - 12 Lfi(2j正交表12345671111221222122111312222214221

16、212251121122621112217121111182221212S 2 - 13某植物试管苗生长正交实验方秦表光愿吋间h d光照强度1XmH值温度tBAmg LNAAmg L麓糖%11(10)1(1 000)1C5.5)2(25)22)1(0-5)2(4)42(14)125想）21(0.5)11(2)312(2 000)2222(1)14221212751121(20)1226211122171匕1111182212122、初代培养物的建立1）、保证无菌2）、条件合适：首先，一定要选择好合适的作物种类、品种 及培养的部位；其次,一定要选择合适的培养基，激素及其他添 加物；还要注意掌握适

17、宜的环境条件。 所以在进行一种植物的组 织培养之前，应查找该种植物有关方面的资料，根据这种植物10 / 26过去所采用的培养部位、 培养基、 培养条件和培养技术等 , 再决 定自己的工作步骤。3）、操作技术过关3、污染的防治1）、植物材料的选择及防止污染 通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多 ; 老 的材料比幼嫩的材料带菌多 ; 田间生长的材料比温室生长的材 料带菌多 ;带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。 为此对于培 养材料的取材就应很认真地加以选择 , 以减少污染的发生。用茎尖作外植体时 , 应在室内或无菌条件下对枝条进行预 培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中

18、, 使 其发枝 , 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体 , 便可大大减少 材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养 ,待 抽出徒长的黄化枝条时取材 , 也可明显地减少污染。对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。 如将切好 的外植体放入 1 .3% 次氯酸盐溶液中 （商品漂白粉 25%的溶液 ）消 毒 30min ,然后用无菌水冲洗 3次,再放在无菌条件下,次日用 2 . 6% 次氯酸钠灭菌 30min , 然后用无菌水冲洗 3 次。也可采用 多种药液多次浸泡法 , 以加强灭菌效果。材料内部易感染病菌,在这种情况下,必须在培养基中加 入抗生素类，防止初代培养物污染。11 / 26表2* U培养基中抗生物质对侦肪樂菌的效果培养种类浓庫（n】gL）抗生物两银杏冬肯月李100+20+ + -F + + + + + +-F地霉素50+ + + + + + -F +夹竹桃需素20斗+斗+ + + + + +斗+ +斗+杆繭at50+