反义寡核苷酸药物现代研究进展-会议论文

1、反义寡核苷酸药物现代研究进展 宋燕青，张四喜（吉林大学第一医院 药剂科，吉林 长春 130031） 摘要：目的：介绍反义寡核苷酸药物现代研究进展。方法：综述了近年来反义寡核苷酸药物的现代研究。结果：反义寡核苷酸在治疗重大疾病如癌症和病毒感染方面很有潜力，越来越受到人们的重视。但以反义寡核苷酸为基础的治疗受到很多因素的限制，如稳定性差，需要多次重复给药、细胞膜透过性差等。结论：人们在提高反义寡核苷酸稳定性和膜透过性等所设计研究方面做出了很多工作，前景广阔。关键词：反义寡核苷酸；化学修饰；脂质体；纳米粒；微球 Research progress of antisense oligonucleoti

2、des SONG Yan-qing , WANG Yan , ZHANG Si-xi(Pharmaceutical Department ,First hospital of JiLin University, Cchangchun 130031,China)反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ONDs）的概念最早提出于1967年,经过30多年的研究，人们已意识到在各种反义寡核苷酸的领域里，有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药1。其主要是根据碱基互补配时原则和核酸杂交原理,利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段,以反向互补方式特异性地与目的基因(单链、双链

3、)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合,从基因复制、特录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达,干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递,从而达到抑制、封闭或破坏靶基因表达,达到治疗疾病的目的。因此,反义寡核苷酸是对多种疾病都有潜在治疗价值的新型药物2。作为治疗药物，ONDs具有以下优点:(1)特异性强，副作用小，一个15聚的ONDs含有30-45个氢键与靶分子作用，而传统的小分子药物与靶点一般只能形成1-4个键;(2)药效高，ONDs是根据中心法则从DNA水平入手，作用于遗传信息的上游，所需的剂量较低;(3)以核酸为靶点比蛋白质作为受体，更易合理设计新药，大大减少新药开发的难度。理论上说只要

4、疾病的相关基因已知，就可合成相应的反义药物,大大缩短新药开发的周期。随着商品名为“福米韦生”的第一个反义寡核苷酸药物，已在临床上用于治疗艾滋病人的巨细胞病毒性视网膜炎，许多抗肿瘤的反义寡核苷酸，包括恶性淋巴瘤癌基因(BCL一2 mRNA)、蛋白激酶c、蛋白激酶A和DNA甲基转移酶(DNA transferase)等反义的寡核苷酸已进入了临床、期试验阶段3。反义寡核苷酸逐渐成为公认的具有高度特异性和低潜在毒副作用的治疗手段然而由于ONDs亲水性的阴离子聚合物，对生物膜的通透性差，更为严重的是其在体内易受血浆和细胞内的核酸酶的降解，稳定性很低，从而限制了它的广泛应用。为了解决这些缺陷,一方面通过对

5、ONDs类药物自身结构进行修饰和改造,以提高稳定性和细胞透过率,另一方面通过药物传递系统来帮助ONDs类药物躲避酶的识别,并使之具有一定靶向性,最终使更多的ONDs类药物能应用于临床4。研究者从多个方面进行了试验。1.化学修饰反义寡核苷酸1.1第一代修饰的ONDs以用硫取代磷酸骨架中氧原子形成的硫代磷酸盐(phosphorothioate，PS)脱氧寡核苷酸(图1)为代表，不仅易于合成、明显提高ONDs的抗核酸酶能力，使其在人血清中的半寿期增加10倍6,7；还可以激活RNase H剪切靶RNA。研究表明5,PS-ONDs能抑制膀胱癌细胞Ej的生长，降低其端粒酶活性，并诱导细胞凋亡。但硫代修饰有

6、如下缺点：使ONDs带多价阴离子，影响了带负电荷的细胞膜对ONDs的吸收率；硫代修饰的核苷内的手性中心(chiral center)降低了寡核苷酸(ONs)与互补RNA之间的亲和性；使ONDs与胞外及细胞膜上的蛋白质发生非特异作用，而增加了ONDs的细胞毒性。12 第二代修饰的反义寡核苷酸 第二代反义核酸（图1），包括嵌合寡核苷酸、杂合寡核苷酸等，作者简介：姓名：宋燕青，女，药师，电话：，E-mail：是在硫代寡核苷酸的基础上，再引入其它的修饰基团，从而提高其生物活性，减少毒副作用。这类修饰的ONDs比PS ONDs毒性低，与互补RNA的亲和力更强7。但用氧烷基取代2羟基改变了双螺旋小沟的宽度

7、，使ONDs失去了原有灵活性，不能诱导RNase H发生剪切作用，仅仅具有空间位阻效应。1.3 第三代修饰寡聚核苷酸 为了进一步提高ONDs的靶向亲和性、核酸酶耐受性，学者们又开发出了许多修饰核苷酸。1.3.1 肽核酸 肽核酸(peptide nucleic acids，PNAs)是继硫代修饰和2氧烷基RNA之后最受广泛关注的核苷酸修饰方法之一，它是用氨乙基甘氨酸单元(aminoethyl glycine units)组成的假肽骨架(pseudopeptide backbone)替代脱氧核糖磷酸骨架(图1)，从而形成一种非手性不带电荷的化合物。研究表明，PNAs能抑制目的基因的转录和翻译8。但

8、由于PNAs是电中性分子，不溶于水，不易被细胞吸收，并不能诱导RNase H的剪切作用。可以将其与阴离子聚合物、脂质体、某些肽类连接提高其细胞吸收率；或与DNA形成嵌合分子部分带电，既提高其细胞吸收率，又具有诱导RNase H剪切靶RNA的能力。 1.3.2 锁核酸 锁核酸(locked nucleic acid，LNA)是用亚甲基将核糖的2氧和4碳连接起来(图1)9，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好和体内无活性等特点10。LNA的引入可使DNA·RNA双链发生趋向于A-型螺旋的构型改变，阻止RNase H剪切靶RNA。2.采用各种载体传递由于化

9、学修饰在提高ONDs的稳定性和对生物膜通透性的同时也降低了对靶序列的亲和力和专一性，因此，许多研究者采用了各种载体传递ONDs，主要可分为病毒类和非病毒类载体。病毒类载体主要有逆转录病毒(RI)、腺病毒(Ad)、单纯疙疹病毒(HSV)和腺病毒相关病毒(AAV)11，12。这类载体转染效果高，对各种细胞都有较好的促渗作用，但是难以大量制备，毒性较大，具有潜在的致癌作用。因此，近年来有越来越多的人把目光转向了非病毒类载体系统的研究，这类载体与病毒载体相比，无免疫原性和致癌作用:生产简单，可大规模制备。常用的有阳离子复合物、多肽复合物、脂质体、微球、微乳、纳米粒以及环糊精包合物等13。2.1 脂质体

10、 应用阳离子脂质体 在所有反义寡核苷酸给药系统中，阳离子脂质体的研究最多，也最为成熟，现已有Transfectin(含N- (2, 3一二油酞丙X-NNN一三甲胺盐酸盐，DOTMA)和Transfactam(含二十八烷基一二甲氨乙酣盐酸盐，DOGS)等专门的试剂上市。现已上市和接受临床试验的反义药物均采用该载体。通过电荷的作用可以有效的使带有负电荷的ONDs结合到脂质体表面或包裹在内部，这样既提高了载药率，同时又保护ONDs免受核酶的攻击。此外，与单纯ONDs相比，复合物更易接近带有负电荷的细胞膜表面，便利细胞通过内吞途径摄取ONDs14。梁文权等15选用带正电的3N-(N，N-二甲氨基乙基)

11、氨甲酰基-胆固醇(DCChol)脂质制备高效促进细胞摄取ONDs和保护ONDs的阳离子脂质体，利用静电作用可以有效载运ONDs，其效果显著优于先前报道的十八酰胺(SA)脂质体16。锥外细胞摄取实验表明：DCChol脂质体对两种不同生长方式的细胞都能显著提高对ONDs的摄入量。在相同用量的ONDs情况下，+，-电荷比值越大，进入细胞内的ONDs数量越多。这是因为：当ONDs一定时，增加DC-Chol脂质体的量，不仅提高了ONDs的载药率，而且微粒表面带有较多正电荷，可以更容易吸附到带负电荷的细胞膜表面，并进一步通过内吞等途径进入胞浆。但实验中也发现，当DC-Chol脂质体用量过多，可对细胞生长有

12、一定的不良影响，因此实际应用时应注意控制脂质体的用量。此外，Olivier等17认为，血清中的成份改变载药脂质体的表面电势和粒径是减少细胞摄取的重要原因故这种微粒的稳定性在体内可能会受到影响。采用制剂学手段，如脂质体表面的结构修饰。可望会削弱这种作用。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证实了包裹于DC-Chol脂质体内部的ONDs具有免遭核酶降解的作用，从而保证了ONDs的疗效，因此DC-Chol脂质体有望成为一种高效的ONDs传递系统。另外，E Fattal等1将反义寡核甘酸包封于脂质体后分散于热敏凝胶中，家兔玻璃体内注射给药，结果表明：脂质包封寡核苷酸pdT16给药系统同溶液剂相比，可以使药物持续

13、稳定释放到玻璃体和视网膜，减少药物向无关组织（巩膜、晶状体）分布。另外，脂质体可以保护反义寡核苷酸避免降解。2.2 纳米粒近年来人们开始对纳米粒作为给药载体的研究，王文喜18、刘伟19等研究表明，各种纳米粒载体都能显著地增强ONDs的细胞穿透性,提高ONDs对核酸酶的耐受性,并能改变其在细胞内的命运。因此纳米粒是一种性能优良的非病毒类ONDs给药系统。王文喜还对反义寡核苷酸的聚甲基丙烯酸酯纳米粒做了系统研究。研究结果表明：采用荧光法对细胞内药物量进行检测，单独使用ONDs时，与细胞作用8h后，今有少量细胞内有药物荧光；使用纳米粒后携带荧光的细胞数和胞内的荧光强度显著增加，表明以纳米粒为载体显著

14、改善了药物的细胞膜透过性，可浓集于细胞内。而且，实验中ONDs不位于溶酶体，而游离的ONDs主要位于溶酶体内。因此，聚甲基丙烯酸酯能改变ONDs的细胞内的命运，逃避溶酶体对ONDs的降解。采用表面活性剂对纳米粒进行表面修饰可以降低纳米粒表面的疏水性。纳米粒表面的疏水性将直接影响到纳米粒与调和蛋白吸附结合力的大小从而影响到吞噬细胞对其吞噬的快慢20。一般而言，纳米粒表面疏水性越大，则对其调和蛋白的结合力越强，吞噬细胞对其吞噬作用也就越强，其在体循环中停留就越短。故要延长纳米粒在体内的循环时间，须降低其表面的疏水性。2.3应用微球E Fattal等1制备了反义寡核甘酸的载药微球及与PEI交联的载药

15、微球，与海拉细胞共同培养，荧光显色结果表明：微球所载反义寡核苷酸专一性浓集于细胞质。交联微球的专一浓集性取决于交联时的NP比，通常NP比15的载药微球细胞质浓集性高于NP比45的载药微球。反义寡核苷酸和核酶作为基因表达的调节因子可应用于临床治疗某些疾病。这一作用的广泛应用还有赖于药物设计的有效性、生物稳定性及作用位点靶向性的提高。随着对这些分子药效学和药代动力学理解的加深,可以选择更好的转运策略,提高反义寡核苷酸的转运。最终,随着反义寡核苷酸设计合理性和转运效率的提高,这种大分子物质将会有广泛的临床应用前景。参考文献：1.E.Fattal，G.De Rosa，A.Bochot. Gel and

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