文冠果壳苷对侧脑室注射Aβ1-42 致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用

1、文冠果壳苷对侧脑室注射A1-42 致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用邹莉波1，王立华2，迟天燕1，纪雪飞1，李伟1，李晓春1，付琪1，杨柏珍2（1.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳110016；2.中科院沈阳生态研究所，沈阳110016）摘 要目的：本论文以侧脑室注射A1-42 致痴呆小鼠为模型，考察了文冠果壳苷对痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并从抗氧化损伤角度探讨了文冠果壳苷对抗A1-42 致痴呆作用的机制。方法：采用小鼠新物体辨别、水迷宫、避暗等行为学测试方法研究文冠果壳苷改善学习记忆障碍的作用，用生化学方法检测脑组织总抗氧化能力（T-AOC）、GSH/GSSG比值、MDA

2、含量及CAT活性。结果：文冠果壳苷( 0.08 0.32mg/kg ) 显著延长新物体辨别实验中对新物体探索时间并提高优先指数；显著缩短水迷宫试验中小鼠到达安全台的时间；显著减少避暗实验中的错误次数，延长潜伏期，缩短总电击时间。生化检测结果表明，文冠果壳苷显著提高模型小鼠大脑组织中CAT活性及T-AOC，减少MDA含量、增加GSH含量并提高GSH/GSSG比值。结论：综上所述，文冠果壳苷能显著改善侧脑室注射A1-42 致痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，其作用机制可能与对抗自由基损伤、抑制脂质过氧化反应等有关。关键词：文冠果壳苷；A1-42；阿尔茨海默病；抗氧化阿尔茨海默病（Alzheimers d

3、isease, AD）的发病机制复杂，涉及多种神经系统功能障碍1，而现有的治疗药物绝大多数作用机制比较单一，如AChE抑制剂等，临床疗效有限，因此，寻找具有综合治疗作用的抗痴呆新药仍是当今医药界有待攻破的一大难题。文冠果 (Xanthoceras sorbifolia Bge) 为无患子科文冠果属植物。一属一种，为我国特有种，在我国东北、华北、西北都有栽培，资源丰富。文冠果果仁与果壳产量比为10:810:9，果壳产量很大，因尚未被研究利用，基本上属废弃物。文冠果壳苷（Xanthoceraside）即是一种从文冠果果壳中提取的三萜皂苷类化合物。前期研究结果表明2，文冠果壳苷能拮抗东莨菪碱、亚硝酸

4、钠、40% 乙醇所致的记忆获得、巩固、再现和空间辨别障碍；显著改善侧脑室注射A25-35致痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，并显著提高模型小鼠脑内的SOD及GSH-Px活性。本论文在前期工作的基础上，进一步考察文冠果壳苷对A1-42致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及机制，为文冠果壳苷开发成治疗AD的新型药物提供依据。 1. 实验材料1.1药品与试剂文冠果壳苷 ( Xanthoceraside )：由中科院生态所提供；银杏叶片：深圳海王药业有限公司，批号20070704；Amyloid (1-42) fragment：北京博奥森生物技术有限公司；微量丙二醛 ( MDA ) 测试盒、氧化型谷胱甘肽

5、( GSSG ) 及还原型谷胱甘肽 ( GSH ) 测试盒、过氧化氢酶 ( CAT ) 测试盒、总抗氧化能力 ( TAOC ) 测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。1.2实验动物昆明种小白鼠，雄性，体重24-28 g，由沈阳药科大学动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2004-008。1.3实验仪器722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；UV-2000型荧光分光光度计，尤尼柯(上海) 仪器有限公司； JY92-超声波细胞粉碎机及DY89-电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司；J2-HS型低温超速离心机，美国BECKMAN；行为学实验装置：小鼠避暗、水迷路、新物体辨别装置均为定制。

6、 2. 实 验 方 法2.1 动物模型的建立3及实验方案取雄性昆明种小白鼠，体重2530 g。将小鼠随机分为6组，每组10只，包括假手术组，模型组，银杏叶片31.2 mg/kg组，文冠果壳苷0.08、0.16、0.32 mg/kg组。将小鼠用3.5%的水合氯醛( 10 ml/kg )麻醉后，参考文献3，4 方法，除对照组外，每组小鼠均侧脑室一次性注入5L凝聚态A1-42（含A1-42 410 pmol，以无菌生理盐水溶解，37 120 h使其成凝聚态），留针1min，对照组小鼠同法侧脑室给与等体积溶剂（1135的DMSO生理盐水）。造模即日起开始给药，至行为学测试结束。给药后第8-9天进行新物

7、体辨别实验，第10-14天进行水迷宫实验，第15-16天进行避暗实验，末次给药后，断头取脑匀浆，测定各种生化指标。2.2 新物体辨别实验参照文献4进行。用测试期对新物体的优先指数来反应小鼠的记忆能力。新物体优先指数是探索新物体的时间占测试期探索总时间的百分比。2.3 小鼠水迷宫法参照文献5进行。每只小鼠每天训练10次，间隔30s。以30s内到达安全区为正确反应。记录小鼠到达安全区的时间，计算每天的平均时间和正确反应次数。2.4 避暗法 参照文献6进行。记录24h后测验期第一次进入暗室的潜伏期、5min内的错误次数和总电击时间，以此作为记忆成绩。3. 实 验 结 果3.1文冠果壳苷对侧脑室注射A

8、1-42 致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用 水迷宫实验实验结果如图1所示，与溶剂对照组相比，模型组在水迷宫实验的第二天开始到达安全台的游泳时间显著延长。与模型组相比，文冠果壳苷各组剂量依赖性地缩短到达安全台的游泳时间。05101520253035the second daythe third day the fourth day the fifth dayLatency (s)VehicleModel Yinxing0.08mg/kg0.16mg/kg0.32mg/kgFig.1. Effect of Xanthoceraside on swimming time in water maz

9、e test in mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd )3.1.2 新物体辨别实验实验结果表明，各组小鼠在训练期对两个相同物体的探究时间无显著差异；测试期模型组小鼠对新物体和旧物体的探究时间仍基本相同，而溶剂对照组、银杏叶片组和文冠果壳苷 0.32mg/kg 组小鼠对新物体的探究时间显著延长；对新物体的优先指数显著增加，与模型组相比有显著差异 ( 见表 1)。Table 1. Effect of Xanthoceraside on preferential index for object 1 or new object in the

10、 novel object recognition in mice with i.c.v. A 1-42 ( n = 10-15, x ± sd ). Training Phase Testing Phase Dose Group ( mg/kg ) Preferential index for object 1 Preferential index for the novel objectVehicle 0.56 ± 0.06 0.65 ± 0.06 Model 0.52 ± 0.16 0.44 ± 0.06# Yinxing 31.2 0.

11、49 ± 0.12 0.64 ± 0.13*Xanthoceraside 0.08 0.43 ± 0.05 0.57 ± 0.07* 0.16 0.46 ± 0.14 0.61 ± 0.10* 0.32 0.53 ± 0.12 0.65 ± 0.13* #P<0.001 vs. vehicle group; *P<0.001 vs. model group.3.1.3 避暗实验实验结果表明：与溶剂对照组相比，模型组测试阶段潜伏期显著缩短，错误次数显著增加，总电击时间显著延长。与模型组相比，文冠果壳苷0.

12、32、0.16 mg/kg及银杏叶片组均能够显著延长潜伏期，并减少错误次数和总电击时间 ( 见表2 )。Table 2. Effect of Xanthoceraside on latency in step-through test in mice with i.c.v. A 1-42 ( n = 12-16, x ± sd ) Group Dose ( mg/kg ) Latency ( s ) Vehicle 224.07 ± 117.25Model 49.53 ± 95.40#Yinxing 31.2 135.64 ± 120.95*Xantho

13、ceraside 0.08 125.43 ± 124.06 0.16 184.80 ± 124.46* 0.32 187.47 ± 115.52*#P <0.001 vs. vehicle group; *P <0.05, *P <0.01 vs. model group3.2 文冠果壳苷抗氧化作用研究3.2.1文冠果壳苷对侧脑室注射A1-42致痴呆模型小鼠T-AOC的影响实验结果如图2所示：与溶剂对照组相比，模型组小鼠T-AOC显著降低。与模型组比较，文冠果壳苷0.16mg/kg, 0.32mg/kg组及银杏叶片组T-AOC显著升高。Xanth

14、oceraside Yinxingmg/kgFig.2. Effect of Xanthoceraside on the T-AOC in the brain of mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.3.2.2 文冠果壳苷对侧脑室注射A1-42致痴呆模型小鼠GSH 、GSSG含量的影响实验结果如图3、图4所示，与溶剂对照组相比，模型组小鼠脑组织GSSG含量未见显著改变， 但GSH含

15、量及GSH/GSSG 显著降低。与模型组比较，文冠果壳苷0.16mg/kg，0.32mg/kg 组及银杏叶组小鼠脑组织GSSG含量未见显著改变，但GSH含量及GSH/GSSG 显著升高。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.3. Effect of Xanthoceraside on the content of GSH in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05 vs. model group.X

16、anthocerasideYinxingmg/kgFig. 4. Effect of Xanthoceraside on the ratio of GSH/GSSG in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n =8-10, x ± sd ). #P < 0.01 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.3.2.3文冠果壳苷对侧脑室注射A1-42致痴呆模型小鼠过氧化氢酶 (CAT) 活力的影响实验结果如图5所示：与溶剂对照组相比，模型组小鼠CAT活力显著降低

17、。与模型组比较，文冠果壳苷0.32mg/kg 组，银杏叶片组CAT 活力显著升高。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.5. Effect of Xanthoceraside on the CAT activity in the brain of mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.01 vs. vehicle group; *P < 0.05 vs. model group.3.2.4 文冠果壳苷对侧脑室注射A1-42致痴呆模型小鼠MDA含量的影响实验结果如图6所示：与溶剂对照组相

18、比，模型组小鼠MDA含量显著升高。与模型组比较，文冠果壳苷0.08mg/kg, 0.16mg/kg, 0.32mg/kg 组及银杏叶片组MDA含量显著降低。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.6. Effect of Xanthoceraside on the content of MDA in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ).#P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.4.

19、讨论有研究表明，氧自由基与A神经毒性有关，应用多光子成像技术，在AD转基因鼠及AD患者的体内外实验都提示A沉积与氧自由基的产生有直接关系，A沉积所形成的淀粉样斑块聚集物内有大量的氧自由基产生。A的神经毒性作用所致的细胞氧自由基损伤主要有以下途径： A本身可作为氧自由基供体，产生活性氧； A可通过诱导使氧自由基产生； A通过与特异的受体结合激活小胶质细胞，产生大量自由基，加剧氧化应激。氧自由基对A的聚集也有重要作用，A肽段的某些氨基酸易受自由基攻击，并使蛋白质分子交联；A的第 35 位氨基酸蛋氨酸( Met35 ) 在疏水区的中部，氧化的 Met35 含有更极性化的基团，使A聚集加速。A亦通过影

20、响脑突触后膜上腺苷酸环化酶的活性,调节 G 蛋白偶联的信号传导影响氧自由基代谢。综上所述，AD 脑组织中氧自由基代谢发生紊乱，A可以看作是氧化应激与AD脑神经元死亡之间的偶联分子7。我们前期研究结果表明，文冠果壳苷能够拮抗东莨菪碱、亚硝酸钠、40% 乙醇所致的记忆获得、巩固、再现和空间辨别障碍；显著改善侧脑室注射A25-35致痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，并显著提高模型小鼠脑内的SOD及GSH-Px活性。本实验进一步证明文冠果壳苷在微克级的剂量下能够显著改善A1-42致痴呆模型小鼠空间学习记忆障碍及物体辨别记忆障碍；显著降低脑组织中MDA含量，提高GSH/GSSG比值，增加总抗氧化能力，提高CA

21、T活力。上述结果提示，文冠果壳苷改善A1-42致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的作用可能与其抗自由基损伤有关。参考文献1 PARIHAR M.S., HEMNANI T. Alzheimers disease pathogenesis and therapeutic interventionsJ. Journal of Clinical Neuroscience, 2004, 11(5 ): 456 - 467.2 LIU X , YANG X A, QU C, et al. Effects of extract of the husk of Xanthoceras sorbifolia Bunge

22、 on learning and memory deficits. J.Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology (中药新药与临床药理) 2007，18（1）：23-253 JIN H J, KIMB H C, T NABESHIMA, et al. -Amyloid(142)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. J

23、Behavioural Brain Research 2004; 155: 185196. 4 Fabian Fernandez, Craig C. Garner. Object recognition memory is conserved in Ts1Cje, a mouse model of Down syndrome J. Neuroscience Letters, 2007, 421: 137 - 141.5 XIAN Y F，QU C, WU Z, et al. Comparision of the effects of CHPQS and CAPQS on learning an

24、d memoryJ. Journal of Shenyang Pharmaceutical University. (沈阳药科大学学报 )2006，（1）43-476 XIAN Y, JI X， LIU X, et al. Experimental Research on Improving Learning and Memory Abilities of Total Sterone Extracts of Rhaponticum uniflorumJ Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology (中药新药与临床药理)

25、 2005, 16(6)405-4087 CROUCH P J., HARDING S M E. WHITE A R., et al. Mechanism of A mediated neurodegeneration in Alzheimers diseaseJ.The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2008, 40:181-198.Effects of Xanthoceraside on learning and memoryimpairment induced by i.c.v. A1-42 in mi

26、ceZOU Li-Bo1*, WANG Li-Hua2, CHI Tian-Yan1, JI Xue-Fei 1, LI Wei1, LI Xiao-Chun1, FU Qi1, YANG Bai-Zhen2 (1. Department of Pharmacology, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang110016, China; 2.Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences

27、, Shenyang110016, China)OBJECTIVE: To investigate the improving effect of Xanthoceraside on learning and memory impairment induced by i.c.v. A1-42 in mice. METHOD: Object recognition test, water maze task and step-through test were used to evaluate the learning and memory function of mice. The activity of catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), the ratio of tGSH/GSSG and the contents of MDA were measured with colorimetry.