中药化学成分单体化合物结构鉴定方法和程序

1、中药化学成分单体化合物结构鉴定方法和程序黄峰中药学2110948107摘要:中药化学成分单体化合物的结构鉴定是深入探讨有效成分的生物活性、构效关系、体内代谢以及进行结构改造、人工合成等的前提条件,本文主要对中药化学成分单体化合物结构鉴定的程序做一个综述,并对所涉及的色谱法、光谱法等在结构鉴定中的运用做一个具体探讨。关键词:化学成分;结构鉴定;色谱法;光谱法前言中医药现代化是当今我国政府大力倡导和中医药领域各位同仁共同努力的奋斗目标,同时也是中华民族文化,尤其是中医药走向世界的重要特征之一。中药中发挥各种药理作用的物质基础(如其中的生理活性成分和有效成分的认知不仅是阐明中药作用机制的基础,也是中

2、医药能够走向世界的关键。从中药中经过提取、分离、精制得到的有效成分,运用各种物理或化学的科学技术鉴定或测定其化学结构,才能为深入探讨有效成分的生物活性、构效关系、体内代谢以及进行结构改造、人工合成等研制提供必要的依据。因此,研究清楚中药中的化学成分是现代科学技术发展和中药现代化的关键步骤。因此,研究清楚中药的化学成分是现代科学技术发展和中药现代化的关建步骤。本文主要对中药化学成分单体化合物结构鉴定方法和程序做一个综述,以在这个基础上,运用我们所学的知识对中药未知化学成分单体化合物进行探索。1 单体化合物结构鉴定的一般程序1.1纯度检测在进行有效成分的结构研究之前,必须对该成分的纯度进行检验,以

3、确定其为单体化学成分,这是鉴定或测定化学结构的前提。一般常用各种色谱法进行纯度检测,此外,固体物质还可通过测定其熔点,考察其熔距的大小作为纯度的参考1。液体物质还可通过测定沸点、沸程、折光率及比重等判断其纯度2。对已知物质来说无论是固体还是液体物质,如其比旋度与文献数据相同,则表明其已是或接近纯品。用于纯度检测的物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重等的测定。固体纯物质的熔点,其熔距应在0.5度1.0度的范围内,如熔距过大,则可能存在杂质,应进一步精制或另用不同的溶剂进行重结晶,直至熔点恒定为止。液体物质可测定其沸点。液体纯物质应有恒定的沸点,除高沸点物质外,其沸程不应超过5度的范

4、围。此外,液体纯物质还应有恒定的折光率及比重。比旋度也是物质的一种物理常数。中药的有效成分多为光学活性物质,故无论是已知还是未知物,在鉴定化学结构时皆应测其比旋度。在用各种色谱法如薄层色谱、纸色谱、气相色谱或高效液相色谱等方法对其进行纯度检验。需要注意的是无论采用何种方法检验,因为仅用一种溶剂系统或色谱条件,可能不一定能够分开所有化合物,其结论常会出现偏差。在用硅胶薄层色谱法或高效液相色谱时,最好使用正相和反相薄层或色谱柱同时进行检验,这样可以进一步保证结论的正确性。一般样品用两种以上溶剂系统或色谱条件进行检测,均显示单一的斑点或谱峰结晶样品的熔距为0.51.0度,液体样品的沸程在5度以内,即

5、认为是较纯的单体化学成分,可用于化合物的鉴定和结构测定。1.2化和物结构类型确定判断未知化合物的基本骨架或结构类型,如确定其母核结构是否为黄酮或者醌类等,可以帮助我们较为容易的认识化合物的波谱谱图,是进行化合物结构解析前非常重要的一步。在判断化合物基本骨架前,可先进行分子式的确定,目前最常用的是质谱法3。高分辨率质谱法不仅可给出化合物的精确分子量,还可以直接给出化合物的分子式。如青蒿素4的HR-MS谱中,分子离子峰为m/z 282.1472,可计算出其分子式为C25H22O5 。也可通过质谱中出现的同位素峰的强度推定化合物的分子式。有时化合物的分子离子峰不稳定,难以用HR-MS谱测出,为确定一

6、个化合物的分子式,需要进行元素定性分析,检查含有哪几种元素,并测定各元素在化合物中所占的百分含量,从而求出化合物的实验式。元素的定性定量分析目前多用自动元素分析仪测定,具有快速、简便等优点。得到一个化合物的实验式后,还要进一步用场解吸质谱、快原子轰击质谱或制备衍生物再测定其质谱等方法测定它的分子量,以求得化合物的分子式。在确定了一个化合物的分子式后,就可以进行分子结构骨架和官能团的确定。判断未知化合物的基本骨架或结构类型。除了用波谱测定推断结构类型(如红外光谱测定官能团外,由于同科、同属生物常含有相同或类似的化合物,应对文献中有关其原生物或近缘生物成分的报道进行调查,以此作为依据做一个母核的初

7、步判断。并且,在进行提取、分离、精制过程中可获得对该化合物的部分理化性质(如酸碱性、极性、色谱行为及显色反应等的认识,两者结合为判断该化合物的基本骨架或结构类型提供重要的参考依据5。1.3化合物结构的确定主要是通过波谱解析得到其结构,另外,通过一定的依据判断其可能为已知化合物时(如前面进行的母核测定等,在有对照品的情况下,最好用对照品同时进行熔点、混合熔点、色谱和红外光谱对照。如果样品与对照品的熔点相同,混合熔点不降低,色谱中的Rf值相同, IR谱相同,则可判定样品与对照品为同一化合物6。若无对照品,则应多做些数据,或制备衍生物与文献数据核对。如果欲鉴定的化合物为文献未记载的物质时,应测定该化

8、合物及衍生物的各种波谱并进行必要的化学反应以确定其化学结构。此时如已推测出该化合物的结构类型,则应充分查找有关该结构类型、结构确定的最新文献。此外,考察它们的生物合成途径也有助于确定其化学结构。值得提及的是近代各种波谱法,在鉴定或确定中药有效成分的化学结构中,发挥着极为重要的作用。下面对主要三个步骤里涉及到的方法做一个介绍。2单体化合物结构鉴定所涉及的方法介绍2.1纯度检测方法目前未知化合物纯度的测定多用薄层色谱,熔点测定作为固体未知物的纯度检测方法,也可以排除其他化合物的干扰,有利于我们进一步进行化合物进行波谱、光谱的结构研究。由于我们分离到的单体化合物多为固体晶体物质,这里作为一种知识的介

9、绍,主要对固体物质熔点测定用于未知化合物的纯度检测做一个介绍。固体物质熔点测定:据中国药典2005版附录VII介绍,固体物质的熔点测定分为3个类型物质分别进行测定,三者分别是7:第一,测定固体易粉碎的物质,我们分离得到的物质主要是这部分,这里主要对这部分物质的熔点测定进行介绍;第二,测定不易粉碎的固体药品(如脂肪、脂肪酸、石蜡等;第三,测定凡士林或其他物质。熔点定义:一个大气压下固体化合物固相与液相平衡时的温度。这时固相和液相的蒸汽压相等。每种纯固体有机化合物一般都有一个固定的熔点,即在一定压力下,从初熔到全熔(该范围称为熔程,温度不超过0.51。熔点是鉴定固体有机化合物的重要物理常数,也是化

10、合物纯度的判断标准。当化合物中混有杂质时,熔程较长,熔点降低。纯物质的熔点和凝固点是一致的8。1经典方法(提勒管法,记载于中国药典2005版附录VII,但较为繁琐,目前用的较少,具体操作如下:将试样装入熔点管中,将干燥的粉末试样在表面皿上堆成小堆,将熔点管的开口端插入试样中,装取少量粉末。然后把熔点管竖立起来,在桌面上顿几下,使样品掉入管底。这样反复取样多次,最后使熔点管从一根长约4050 cm高底玻璃管中掉到表面皿上,多重复几次,使样品粉末紧密堆积在毛细管底部。为使测量结果准确,样品一定要研地很细,填充要均匀且紧密。载热体一般称为浴液,根据所测物质地熔点选择。一般用液体石蜡,硫酸,硅油等。毛

11、细管中的样品应位于温度计水银球的中部,可用乳胶圈捆好贴实(胶圈不要浸入溶液中,用有缺口的木塞作支撑套入温度计放到提勒管中,并使水银球处在提勒管的两叉口之间。加热,载热体被加热后在管内呈对流循环,使温度变化比较均匀。在测定已知熔点的样品时,可先以较快速度加热,在距离熔点1520时,应以每分钟12 的速度加热,直到测出熔程。在测定未知熔点的样品时,应先粗测熔点范围,再如上述方法细测。测定时,应观察和记录样品开始塌落并有液相产生时(初熔和固体完全消失时(全溶的温度读数,所的数据即为该物质的熔程。还要观察和记录再加热过程中是否有萎缩、变色、发泡、升华及炭化现象,熔点测定至少要有两次重复数据,每一次都要

12、用新毛细管重新装入样品。2显微熔点仪测定熔点(微量熔点测定法:该类仪器型号较多,共同特点是使用样品量少(23颗小结晶,可观察晶体再加热过程中的变化情况,能测量室温到300样品的熔点,其具体操作如下:取两片干净且干燥的盖玻片将样品夹在中间,用手将样品撵碎,放在载玻片上将样品送入加热平台上,用手柄调节显微镜高度,直至可以清楚的看到晶体。打开控制器上加热开关,调节旋钮I和II使调节器上电压达到100,先让仪器快速升温,待温度升至距样品熔点值约差20左右时放慢速加热速度,控制温度上升速度为每分钟2左右。当样品结晶棱角开始变圆时,表示熔化已开始,结晶形状完全消失表示熔化已经完成,记录熔程。测毕停止加热,

13、稍冷,用镊子取出载玻片,将装有样品的盖薄片放在小烧杯中,将散热片放在加热台上,使其快速冷却,以便再次测试用。使用仪器前必须仔细阅读使用指南,严格按照操作规程进行。2.2中药有效成分的波谱测定方法红外光波波长位于可见光波和微波波长之间(0.751000um。其中,近红外光区在0.82.5um(125004000cm-1、中红外光区位于 2.525um(4000400cm-1和远红外区251000um(40025cm-1。相应地有近红外光谱、中红外光谱和远红外光谱。近红外区用于含有与C、N、O等原子相连基团化合物的定量,远红外区主要用于无机化合物研究等。红外光谱主要是利用中红外光区(4000400

14、cm-1进行有机化合物的结构鉴定。红外光谱在有机化合物结构推测中的应用鉴定是否为某已知成分红外光谱用于官能团测定较为普遍,测得的光谱与标准物质对照,在相同的测定条件下图谱完全相同则为同一化合物(光学异构体或同系物除外。与标准图谱进行核对,如Sadtler标准光谱等,图谱完全相同为同一化合物(光学异构体或同系物除外。但要注意所用的仪器是否相同,测绘条件(如检品的物理状态,浓度及使用的溶剂是否相同,这些条件都会影响红外图谱的差别。检验反应是否进行,某些基团是否引入或消去化合物分子的几何构型与立体构象的研究如化合物CH3HC=CHCH3具有顺式与反式两种构型,这两种化合物的红外光谱在1000650c

15、m-1区域内有显著不同,顺式的=CH在690cm-1出现吸收峰(s,反式在970cm-1出现吸收峰(vs。对于未知样品,通过根据红外光谱的峰位、峰强和峰形,判断化合物中可能存在的官能团,从而为未知物的结构鉴定提供有价值信息。浅谈红外光谱的解析主要是掌握影响振动频率的因素及各类化合物的红外特征吸收谱带的基础上,可按八大区段进行分析,指认谱带的可能归属,结合其他峰区的相关峰,确定其归属。在此基础上,再仔细归属指纹区的有关谱带,综合分析,提出化合物的可能结构,必要时查阅标准图谱或与其他光谱,确证其结构。红外光谱用于结构分析存在的缺陷与其他光谱比较,红外光谱谱图的解析更带有经验型、灵活性。影响红外光谱

16、谱带的数目、频率、强度及形状的因素很多,即使是简单的化合物,红外光谱谱图也会比较复杂,单凭红外光谱确定未知物的结构式困难的。紫外光分为近紫外光区(200-400nm和远紫外光区(1-200nm两个区段,在天然药物的结构分析中,以近紫外最为有用。UV光谱的应用一般来说,UV光谱主要可提供分子中的共轭体系的结构信息,可据此判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。UV光谱在中药有效成分的结构确定中提供的信息较少,但对某些具有共轭体系类型的中药有效成分,如蒽醌类、黄酮类以及强心苷类等成分的结构确定却有重要的实际应用价值。另外紫外光谱可以用来区分顺、反异构体。一般来说,反式异构体的Rmax和最大吸收峰都

17、大于相同的顺式异构体。因为反式异构体系共平面性好,容易发生共轭,故最大吸收波波长向长波方向移动,最大吸收峰值也增大。UV光谱的应用于结构分析存在的缺陷UV光谱只能给出分子中部分结构的信息,而不能给出整个分子的结构信息,所以单独以UV 光谱不能决定分子结构,必须与IR光谱、NMR谱、MS谱以及其他理化方法结合才能得出可靠的结论。2.2.3.NMR光谱NMR光谱能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境以及构型、构象的结构信息。目前,分子量在1000以下、几个毫克的微量物质甚至单用NMR 测定技术也可确定它们的分子结构。因此,在进行中药有效成分的结构测定时,NMR谱与其它光

18、谱相比,其作用最为重要。(11H-NMR谱1H-NMR谱的化学位移范围在020ppm,正常1H-NMR谱技术能提供的结构信息参数12,主要是化学位移、偶合常数(J及质子数。H核因周围化学环境不同,其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同,不同类型的1H核共振信号出现不同区域,据此可以识别。偶合常数是磁不等同的两个或两组氢核,在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分,其形状有二重峰(d、三重峰(t、四重峰(q及多重峰(m等。裂分间的距离为偶合常数(J。氢核磁共振波谱解析的辅助方法13对于复杂的自旋体系,完全、甚至部分解析谱图都是相当费时的,有时甚至是不可能的。然而,幸运的是,现已有许多

19、新技术和新方法,使谱图的解析变得越来越容易。高磁场核磁共振波谱一个化合物中氢的化学位移和偶合常数是不随仪器变化的,但是各种仪器兆赫数不同,1个化学位移单位所含的赫磁数就大,如以Hz为单位,其距离就大。这样,用高磁场强度仪器作图便把谱图拉开了,非常有利于谱图解析工作的开展。化学位移试剂在样品的溶液中增加含有顺磁性的金属络合物。就可以发现各种质子的信号发生不同程度的顺磁性或抗磁性位移。使样品的质子信号发生位移的试剂叫做化学位移试剂。NOE效应NOE是在核磁共振中选择的照射一种质子使其饱和,则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子的信号强度增高的现象。它不但可以找出互相偶合的两个核的关系,还

20、可以反映出不互相偶合,但空间距离较近的两个核间关系。重氢交换活泼氢原子如OH、COOH等的化学位移受多种因素影响,为了鉴定它们,可用重氢交换法。如果待测溶液是非水溶性的,可加入几滴D2O,振荡后静置分层再测定,原有活泼氢的峰消失,而在化学位移4.74.8左右出现HOD的质子吸收峰。如溶液是水溶性的(DMSO-d6,加D2O后产生HOD水峰,可几次用D2O交换除去水峰。浅谈1H-NMR图谱解析14一般由简到繁,先解析和归属容易确定的集团和一级谱,在解析难确认的基团和高级谱。在很多情况下,比较复杂的化合物光靠一张1H-NMR谱图是难以确定结构的,应综合各种测试数据加以解析。必要时有针对性地做一些特

21、殊分析。例如:重氢交换确认活泼氢等及2D-NMR 确认指配的基团及基团间的关系等,特别是2D-NMR在新化合物的结构解析中玩玩是必需的。解析谱图步骤:先检查图谱是否合格,即:基线是否平坦;识别“杂质”峰,如溶剂峰等已知分子式则先算出不饱和度根据积分曲线的高度,算出各信号的相对强度,即相当于各种氢核的数目。首先解析CH3O-,CH3N-等孤立的甲基信号,这些甲基均为单峰,然后再接解析有偶合的CH3信号。解释芳氢信号,一般在6.58附近,偶合常数特征性较强,如邻位等偶合关系的确定。若样品中含有-OH或-NH等活泼氢基团,则加几滴重水以后的图与未加前进行比较,解析消失的信号。需注意,有些具有分子内氢

22、键的羟基信号不消失,相反有些CH中1H核信号会消失。解释图中一级谱,找出化学位移和偶合常数,解释各组峰的归属,然后再解释高级谱。合用其他技术。1C-NMR谱化学位移范围宽,对化学环境有微小差异的碳核也能区别,这对鉴定分子结构是极为有利的;驰豫时间长,不同种类的碳原子驰豫时间也相差较大,这样可以通过测定驰豫时间来得到更多的结构信息。1C-NMR的应用在各方面与1H-NMR谱相比毫不逊色,但它也有一些弱点,例如,样品需要量大,累加时间也较长,这对于一些提取困难的微量天然有机化合物来说无疑是不利的。1C-NMR谱提供的结构信息是分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移,异核偶合常数及驰豫时间,其中

23、利用度最高的是化学位移。常见的1C-NMR测定技术如下15:质子噪声去偶谱质子噪声去偶谱:其测试原理在测定NMR谱时,以一相当宽的频率(包括样品中所有氢核的共振频率照射样品,由此去除13C和1H之间的全部偶合,使每种碳原子仅出一条共振谱线,此时H的偶合影响全部被消除,简化了图谱,对判断C信号的化学位移十分方便。因照射H后产生NOE现象,连有H的C信号强度增加。季碳信号因不连有H,表现为较弱的峰。偏共振去偶谱质子噪声去偶谱使得13C-NMR谱线简化,增加了大部分谱带的高度,但同时也失去了许多有用的结构信息,不便识别伯、仲等不同类型的碳原子。它的实验方法是采用一个频率范围化合物的分子量、分子式、样

24、品来源、物理化学性质等，提出一种或几种最可能的结构。 分析所推导的可能结构的裂解机理，看其是否与质谱图相符，确定其结构，并进一步解释 质谱，或与标准谱图比较，或与其他谱结合，确认结构。 3 结论 波谱法已成为研究天然药物化学成分结构的一种重要的和主要的手段。 各种波谱法各有特点 和长处， 对于比较复杂的有机化合物结构的鉴定， 需要综合各种波谱数据， 并将必要的物理， 化学性质结合起来，彼此补充，进行综合解析，才能最终确证化合物的化学结构和构型。相 信未来在各种新旧方法的综合运用上，单体化合物的结构鉴定将进一步得到发展。 参考文献 1 贝琦华，陈英.药品熔点测定中的影响因素分析J. 今日药学.2009,9(19:7-8. 2 贝琦华，陈英.不同传温介质熔点测定的应用与比较J. 中国药师.2010,13(1:152-153. 3 余 志 立 , 高 丽 梅 , 山 广 志 ， 等 计 算 化 合 物 分 子 式 的 五 种 方 法 J. 质 谱 学 报 . 2004 ,25(2 :18-19. 4 梅林,石开云,苏建华,等.青蒿素国内研究进展J. 激光杂志. 2008, 29(3 :89-92. 5 宁永成.有机