动物细胞转染基础知识大全

1、转染转染(transfection指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。转染方法的分类对外源基因转染方法的要求包括:转移效率高,不影响细胞正常生理活动,低毒性,容易使用,重复性好,易获得稳定转化子.根据转染的机制不同可划分为化学转染法和物理转染法两大类.一、化学转染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE葡聚是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一, DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取,用DEAE-葡聚糖转染成功地用用于瞬时表达的研究,但用于稳定转染却不是十分可靠。2.磷酸钙法磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法,因为试剂易取得,价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳

2、定转染的研究,先将DNA 和氯化钙混合,然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀,最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上,通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA 免受降解.3.人工脂质体法人工脂质体法采用阳离子脂质体,具有较高的转染效率,不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系,而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA,以及RNA和蛋白质。此外,脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达,与以往不同的是脂质体还可以介导DNA 和RNA 转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物

3、,当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质,随后DNA 复合物被释放进入细胞核内,至于DNA 是如何穿过核膜的,其机理目前还不十分清楚。二、物理方法1.显微注射显微注射虽然费力,但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。2.电穿孔这种方法常用来制备转基因动物,但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物园生智体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系。3.基因枪法基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内,这种方法适用于培养的细胞核在体内的细胞。如何提高转染实验成功率【组织培养试剂】一般

4、提示:优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂,并经可能减少所用试剂的变更。基础培养基目前所使用的各种市售培养基(如,RPMI 1640和DMEM。培养基的成分包括营养物质(氨基酸,葡萄糖,维生素,无机盐和缓冲物质。有些成分非常不稳定,因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质,如HEPES,当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应,但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下,如荧光素酶的测定,细胞毒性则仍然是一个问题。胎牛血清血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长

5、抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。因此血清易受显著生物学变异的影响。添加剂某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质(如,生长因子,微量元素,必需代谢物和蛋白等。CO2培养箱细胞生长所需环境为37、相对湿度为95%的CO2培养箱。用CO2是为了控制pH值。细胞生理对pH的变化非常敏感,因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要CO2浓度为5%来有效控制pH 值,而另一些则需要10%的CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2

6、则会导致实验结果的板间变异性。来自于培养箱内的污染物、化学物质,或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。【细胞】一般提示:密切观察您的细胞;确保它们状态良好。在开始转染细胞之前,先制定一个适当的种板方案,使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。增加成功几率细胞是转染过程中的一个关键元素,它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。分裂细胞相比较非分裂细胞分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言,细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于生长过度的状态。由于FuGENE® 6和HD转染试剂对于细胞作用温和,可同时进行

7、贴壁细胞的种板和转染。此外,还常用促有丝分裂刺激物(如,病毒转化,生长因子,条件培养基,以及滋养细胞来活化原代培养细胞。贴壁细胞相比较悬浮细胞在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞(如HL 60,Jurkat非常难以转染;相反,天生为贴壁的细胞(如HEK,CHO则可适应悬浮生长的条件。那些天然悬浮的和那些适应悬浮的细胞的浆膜是不一样的。据推测转染过程中的一个限制步骤就是通过内吞作用摄取转染分子(DNA 或RNA与转染试剂的复合物;然而,目前对此尚未有分子水平上的合理机制的解释。细胞间膜结构的差异可能是某些细胞类型天生难以转染的部分原因。所以,寻找更有效转染试剂的工作

8、目前还主要是经验性的,尤其对于那些天生为悬浮的细胞而言更是如此。这常常是在不含血清而含有抑制转染的特殊添加剂的培养基中发生。经小心处理后,这些细胞可适应于在没有添加剂的环境中悬浮生长。如果这些适应于悬浮生长的贴壁细胞在没有这些添加剂的环境中生长,那么它们就可以被转染。分批方案在对培养细胞进行分批传代培养之前,必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同(如,胰蛋白酶消化时间的延长,胰蛋白酶的失活,以及消化后直到转染开始的时间都可能对转染实验有所影响。如果在转染时细胞过于密集,那么种到培养板上的就会是细胞团块而非单个细胞。对于某些细

9、胞/试剂组合而言,浆膜状态被改变后有可能会影响到所用试剂和DNA的最佳配用量和配比。传代次数传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内。在某些情况下,自建立细胞系起的确切传代次数无法得知。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定,可能会随着培养时间的延长而改变,视不同的细胞系和培养条件而定。培养条件的不同可引起克隆选择。因此名称相同的同一细胞系有关其生理学和形态学(以及转染能力性质可能会有很大的差异。一般而言,细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。在不同细胞系之间转染效率的变化很大。某些细胞系在传代很大次后仍能保持稳定的转染效率,而其他一些则传代很

10、少次数就表现出转染效率的差异。细胞数量(汇聚度只要培养基质(组织培养皿尚有空间,细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言,细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制,但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及它们随后直到细胞溶解之前的生长情况相关。培养物污染培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。支原体污染支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%,它可改变细胞生长特性,酶的作用途

11、径,细胞膜的组成,染色体结构,以及转染效率。特别是,支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰,其结果致使转染效率偏低或非典型。这些效应会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。和细菌及真菌不同,支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。交叉污染如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞,那就有可能发生交叉污染,即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种,几个月过后它们

12、就会完全取代目标培养物。这种变化是逐渐发生的;而您可能甚至还未发现。建立细胞系鉴定的检测标准。例如,对于人类细胞系而言,STR (短串联重复序列图谱就是一种可靠的鉴定方法。或者更简单的解决方案就是,当怀疑有交叉污染时,如果有可能,就换用新鲜的,传代次数少的细胞源。【载体DNA】一般提示:对您纯化所得的载体进行质量检查。确定支持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在对您细胞体系的参数进行测定时,一定要选用一种您已知具有功能的对照载体。载体的完整性种载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解,以及来自于储存和处理过程

13、中的物理压力的影响。载体制备物-各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物(如CsCl,内毒素可能会影响转染效率。载体构造(启动子/增强子/ORI转染体系通常用带有强病毒调节元件(如,RSV,CMV,和SV40的对照载体进行优化和比较。然而,病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如,在某些细胞系中,由于自发的质粒扩增,SV40体系可高效表达large T抗原(如,COS;而在其他许多细胞系中,则是CMV启动子更为有效。除此之外,各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异,这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。【转染方案】一

14、般提示:建立一套适当的转染方案;首先从一种标准方案开始,然后通过改变试剂/DNA的配比和形成复合物的数量进行优化。转染复合物的制备诸如转染试剂/DNA配比,离子强度,缓冲液pH值,以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒既可在无菌水又可在TE缓冲液中稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂,就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。需要对试剂提供方给予一定的信赖;除非您有很好的理由支持您做出改变,否则就应当严格按照他们所推荐的转染方案。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清,它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节,

15、对于不同的转染试剂而言可能差别很大。转染试剂/DNA配比(负载比所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。为了寻找这种最佳配比往往会花费大量的时间和金钱。除了配比的重要性之外,所加入转染复合物量的多少也非常关键。形成转染复合物所用的稀释剂对于多数试剂而言,很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基和盐溶液中形成。复合物数量对转染细胞所用的转染试剂/DNA复合物的量也应当进行优化。如果用量太少,那么转染DNA的表达就太弱;如果用量太多,则可能由于细胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表达。最佳用量

16、通常都必须进行实验来确定。所需要的转染复合物用量与所用细胞的数量相关。转染细胞越少,所需复合物就越少。转染复合物的加入有两种替换方法可用来浆转染复合物加入转染细胞:1. 将复合物浓缩液逐滴加入培养基,或者 2. 将转染复合物先用培养基稀释,然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便,而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性,所以会使结果的一致性更好。转染培养基转染过程中所使用的培养基对转染效率可能会有正面或负面的影响。甚至对于基础培养基配方而言也是如此,尤其是在培养基中加入牛血清的情况下。胎牛血清的存在会使多种转染试剂的转染效率降低。某些公司还提供可与转染试剂配合使用的优化无血清转染培

17、养基。而由罗氏应用科学部所提供的转染试剂则无论是否存在血清都能有效转染。FuGENE® H D是独一无二的能够转染保存在100%血清中肿瘤细胞的转染试剂。如果有抗生素(如,青霉素、链霉素、或两性霉素B存在的情况下培养细胞,则转染有效性会降低至25%。因此,对于瞬时转染,我们建议使用不加抗生素的培养基。【时间进度】一般提示:要确保最终结果的成功;建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目标蛋白能得到最佳表达。转染的开始在转染前12小时,将细胞分种于培养板中。在转染开始时,培养物应当有约50-80%汇聚,这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的汇聚。如果在转染中去掉血清,

18、细胞可能会暂时停止生长。细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。在这段时间后,就不会再发现转染效率有所增长。培养基更换某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行,那么这一步骤就必不可少。至于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂(如,FuGENE® 6 转染试剂或FuGENE®HD 转染试剂时,如果有足够的培养基用于后续表达阶段,就可以省略这一步。如果将转染复合物留在细胞中直到进行检测,那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高,而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。虽然在转染步骤之后转染试剂/

19、DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除,但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。如果转染细胞需要生长3-7天,换培养基就尤其重要,这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。【有血清时的转染】血清一度曾被认为会降低转染效率,但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清,在转染过程中是可以使用血清的。转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液:在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基,因为血清会影响复合物的形成。但在复合物形成后,在加入细胞中前可以加入血清。阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会

20、有所不同,因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞,可以使用OPTI-MEM培养基,一种营养丰富的无血清培养基,或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议使用LIPOFECTAMINE 2000。【培养基中的抗生素】抗生素,比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

21、这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的抗生素量。【细胞维护和培养的演变】可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次,稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过24小时。大多数已建立的细胞系都是非整倍体,原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种

22、变化,融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此,如果观察到转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。或者,几种来源于经筛选,转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。【细胞铺板密度】用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时,贴壁细胞密度为70%-90%,悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感,所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板

23、细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的,CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE试剂的量也相应增加了。这些结果说明,对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。【启动子的选择】获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子,如SV40和RSV(劳斯肉瘤病毒相比,在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系,如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurka

24、t细胞中CMV启动子,而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7时会提高,因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。【DNA量】高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。以前研究者使用CsCl梯度离心得到的DNA进行转染,但是这种方法费时费力。其他的质粒纯化技术如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用独特的阴离子交换树脂纯化DNA,可以得到用于转染的高质量DNA。另外, Marligen的纯化系统实验步骤很简单,可以在2小时内完成。【瞬时和稳定表达

25、】DNA转染后,转入基因的表达可以在1-4天内检测到。仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内,大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释;一周后就检测不到其存在了。瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基因的表达。因此,表达水平与位置无关,不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少,但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大,实验必须很小心。为了进行稳定表达,转入的基因必须能和细胞同步复制。在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。在一小部分转染的细胞中,加入的DNA通过重组整合到基因组上。包含

26、整合DNA的细胞很少,必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。稳定基因表达实验需要数周,如果需要验证蛋白产量,所需的时间更长。但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。【瞬时转染和转染效率的监测】基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。可以使用报告基因来确定优化条件,其表达蛋白易检测,在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶(CAT,绿色荧光蛋白(GFP,荧光素酶(Lux或Luc以及b- 半乳糖苷酶(b-gal。可以使用简单的非同位素方法检测b-gal的表达以测定转染

27、效率和活性。pCMV-SPORT- bgal质粒包含CMV启动子调控下的LacZ 基因,转染入真核细胞内后可以直接表达bgal。结合简单的检测步骤,可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。【稳定转染细胞系的筛选】连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸转移酶基因(APH或neor可以合成APH酶,通过磷酸化使药物失活,从而提供对GENETCIN选择性抗生素(G418 Sulfate的抗性。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上,也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染,两个质粒都可能整合形成稳定转化子。对于两种不同质粒的共转染,

28、带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株的高效方法。瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。比如,使用LIPOFECTAMINE PLUS试剂得到的NIH 3T3细胞GENETICIN抗生素抗性克隆的数目比单独使用LIPOFECTAMINE增加了大约3倍。要进行稳定的表达分析,在转染后次培养细胞,低密度铺板,给予生长空间,在几天或数周内保持筛选压力。生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到GENETICIN抗生素的影响。转染后,在开始筛选前等待48-72小时,使细胞表达足够量的抗性酶,保证在开始筛选时可

29、以自我保护。转染后48-72小时倒掉培养基,加入含有GENETICIN抗生素的培养基,抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定,足够杀死未转染细胞。因为许多因子影响到筛选所需的GENETICIN抗生素的最佳浓度,包括细胞类型,培养基和血清浓度等,所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线,确定最佳浓度(参见第7章实验步骤。筛选最多可能需要一周时间,因为在致死剂量的GENETICIN抗生素存在条件下,细胞会分裂1-2次。在次培养细胞时使用较低剂量的抗生素,一般是筛选剂量的一半。筛选后的细胞一般是离散的克隆,根据实验目的不同,可以分别纯化(克隆,收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。【蛋白表达和培养基的

30、选择】哺乳动物细胞系合成可溶的,翻译后修饰的蛋白,比细菌,真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白,而瞬时转染细胞可以快速表达,迅速地合成小量蛋白。常用的细胞系包括CHO,293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F,293-H, COS-7和CHO-S细胞,来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。但

31、更倾向于使用无血清培养基表达蛋白,因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培养基低得多。无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基,无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。在部分情况下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S,对于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞,可以使用其培养基进行转染。其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转

32、染的成分。在这些情况下,有必要在诸如D-MEM或OPTI-MEM等培养基中进行培养和转染。脂质体介导DNA转染法脂质体(lipofectin regeant,LR试剂是阳离子脂质体N-1-2,3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物1:1(w/w。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找

33、出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从15g和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间(2 24小时。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。1、操作步骤方法一:(1:取6孔培养板(或用35mm培养皿,向每孔中加入2mL 含12×105个液,37CO2培养至40%60%汇合时(汇合过分,转染后不

34、利筛选细胞。(2转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量A液:用不含血清培养基稀释1-10g DNA,终量100L,B液:用不含血清培养基稀释2-50gLR,终量100L,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致,应酌情减量。(3转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL 不含血清培养液。(4转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37温箱置624小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。(5其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意:转染时切勿加血清,血清对转

35、染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二:(1以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿培养24小时,使其达到5060%板底面积。(2在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下:在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。室温下放置510分钟,使DNA结合在脂质体上。(3弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37培养35小时。(4再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养1424小时,(5吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%

36、FCS的DMEM,2mL/孔,再培养2448小时。(6用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。稳定的脂质体转染方法如下:(1接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。(2DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2、(3步骤。(3在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37培养48小时。(4吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞筛选法进行。转染实验要注意的一些事项DNA转染后,转入基因的表达可以在1-4天内检测到仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内,大部分外源DNA会被核酸酶降

37、解或随细胞分裂而稀释;一周后就检测不到其存在了。因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染(transient transfection指的是转染的核酸不整合到染色体上,结果是短暂的高水平表达,可在2496小时内检测表达效果,表达水平与位置无关,不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少,但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大,不长久也不稳定。超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。瞬时表达适合研究启动子等调控元件不过,诱导型的启动子除外。稳定转染,就是转染的质粒DNA整合到染色体上,或者相当于附加子(episome可持续存在,使得转染的细胞可长期表达。外源

38、基因整合的几率很小,要获得稳定转染的细胞株,通常需要有筛选标记(比如抗性基因共同转染,通过选择压力维持表达的稳定不行的统统枪毙了。质粒整合到染色体上本来就是件稀罕事儿,平均万分之一的几率,如果是线性化DNA转染,那整合的几率就高多了。不过怎么整合也就是一个或者有限的几个拷贝,所以表达量往往比较不高的。但是,“压倒一切的是'稳定'”,很多时候,转染后往往要进行稳定表达的筛选。成功转染第一步:细胞培养注意事项细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要,有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞,通常越是难于伺候。反之亦然。此外

39、细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法;而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素,姑且不论。不过因为受限于特定的细胞,如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法,照做可也。如果是个新来的细胞株,最好查查资料看哪些成功转染案例。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,看看其中是否有你的新对手这个FuGENE 6 比较有优势,已有750多种细胞系成功转染的资料可供参考。当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢?一、健康而茁壮成长的细

40、胞转染前细胞最好经过12次传代,以保证细胞生长旺盛,容易转染。注意,贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代,千万不要使细胞保持融合超过24小时。大多数已建立的细胞系都是非整倍体,细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化,这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化,融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率(融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率。因此,如果观察到转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。二、恰到好处的铺板密度转染时的细胞密度对转

41、染效率影响非常显著。不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低,乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数,有的要求细胞90%汇片;而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%80%之间,总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染,以求最佳的转染效果。不同的

42、实验目的也会影响转染时的铺板密度,比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因,就需要较低的铺板密度,所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。需要特别注意。三、温暖舒适的培养基健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性,需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。血清血清一度曾被认为会降低转染效率,老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染,对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天,对于主流的转染试剂来说,血清的存在已经不会影响转染效率,甚至还有助于提高转染效率,比如FuGENE6、Effectene和GeneJu

43、ice等。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说,血清的存在会影响DNA转染复合物的形成,但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了,在转染过程中是可以使用血清的。这些方便好用、可在有血清条件下转染的试剂包括前面介绍的Lipofectamine2000, FuGENE 6,GeneJuice,Effectene,Polyfect等等。最厉害的是Qiagen的2个产品,Polyfect和Effectene,全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作,包括稀释步骤,不用担心培养基的变化对细胞生长有什么不良影响了。这样,就不再需要在转染前多次洗细胞,

44、也就减少操作的复杂程度,更重要的是不必再让细胞处于无血清的“悲惨环境”中转染,不必担心对血清缺乏很敏感的细胞受到不必要的麻烦了。娇贵的细胞们,你们有福了。不过要特别注意:对于RNA转染,如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。抗生素支原体、细菌、真菌污染,无论对于细胞培养或者转染都可能会严重影响转染结果,细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这可

45、能间接导致细胞死亡,造成转染效率低。所以,对于选择Lipofectamine2000系列转染试剂的实验,要特别注意在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的抗生素量。这里又要表扬Qiagen的2个产品,Polyfect 和Effectene,因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作,很方便的。对于筛选稳定表达株,要预留足够的时间让

46、抗性基因表达后再添加筛选压力。其他添加物如抗生素,EDTA,柠檬酸盐,磷酸盐,RPMI,硫酸软骨素,透明质酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖这些物质的存在可能会干扰DNA和转染试剂形成复合物的过程,要尽量避免。一、质粒的构建:启动子的选择启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响,但是对转染结果却有着微妙的影响。启动子可分为2大类:诱导型启动子是比较精明的,平时歇着,一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。而组成型启动子比较老实的,就是从头到尾不停干活从不闲着的那种比如我们很熟悉的CMV启动子,SV40,pMC1,PGK 启动子等等。获得高转染活性所需选择的启动子

47、依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。在BHK-21中,CMV启动子活性比其他启动子如SV40和RSV都要高。但这三种病毒启动子在T 细胞来源的细胞系,如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子,而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有T抗原(存在于COS-1和COS-7时会提高,因为T抗原可以刺激染色体外的合成。一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的,但是对于转染本身来说却不一定好因为任何持续过高表达外源基因都

48、可能带来某种程度的细胞毒性,影响细胞生长如果外源基因本身对细胞生长有毒,那更完蛋了,你很可能筛不到转染成功的细胞株,更别提稳定转染了因为过量表达本身可能已经害死了那个转染了的细胞,没转染的细胞又死于筛选压力。这种时候一个不那么“能干”的启动子可能更适合一些。如果你曾经遇到原因不明的转染失败案例,会不会是这个原因呢?过犹不及就是这个道理咯。诱导型启动子对于转染来说,特别是稳定转染,可能是更好的选择。它使得目的基因的表达可以受到我们的调控转染的时候不表达,筛选稳定表达株后再诱导表达,使得表达有毒性的基因或者精确分析表达产物的生物学效应成为可能。多数诱导型启动子在接受某种信号后“打开开关”开始工作,也有的相反,在缺失某种信号后打开开关。Clontech还有个诱导系统是“剂量依赖的”,就是说不单表达开关可控,表达量多少也可以通过诱导剂的量来调控。还有一种特殊的启动子很好玩具有时序性或者组织特异性(空间特异性,会受到特定的元件调控,在一定的时间或者特定组织细胞中表达的,比如那个转基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺细胞中表达的启动子有人说这是组成型的,我觉得应该是诱导型的,只不过诱导的因素我们不知道罢了,这类启动子在不同的细胞中会有不同的表现,需要注意。诱导系