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文档简介
1、牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、试验目的1、学习从牛乳中分别酪蛋白的原理和方法2、把握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸取法测定蛋白质浓度的原理,生疏紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、试验原理1、预备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。酪蛋白是白色、无味的物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子的水和力量很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的PH调至4.7时,酪蛋白就沉淀
2、出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。2、紫外吸取法测定蛋白质浓度的原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在,在紫外光280nm有吸取高峰,可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280nm也有吸取,干扰测定,不过核酸的最大吸取峰在260nm,通过测定在280nm和260nm时A的比值,然后通过计算消退核酸存在的影响,可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色,最大吸取峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸取峰转变为595nm
3、,考马斯亮蓝G250蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在肯定范围内,考马斯亮蓝G250蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度的测定。三、试验器材与试剂1、制备酪蛋白:烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸取法:紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法:紫外可见光分光光度计、试管1.5cm15cm(9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白(0.1mg/ml)
4、、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、试验步骤制备酪蛋白1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至402、将20mL牛奶加热至40,在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温,4000rpm离心5min,弃上清,得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次,3000rpm离心5min,弃上清6、在沉淀中加入20mL95乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次(10ml/次),最终用乙醚洗涤沉淀2次(10ml/次),抽干8、将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋
5、白纯品9、精确称量,计算含量和得率紫外光吸取法1取待测样品溶液置于的石英比色皿中,于分光光度计波长280nm和260nm,分别读取A280nm和A260nm,用生理盐水为比色空白对比。2若A280nm/A260nm1.5,用公式:蛋白质含量(mg/ml)=A280nm/6.3*10若A280nm/A260nm1.5,用公式:蛋白质含量(mg/ml)=1.45A280nm0.74A260nm考马斯亮蓝法取9支洁净试管,按表进行编号并加入试剂。混匀,室温静置3min,以第1管为空白,于波长595nm处比色,读取吸光度,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(g/ml)作为横坐标作图得标准曲线。五、试验数据酪蛋白质量:0.5421g酪蛋白含量:2.71g/100ml牛乳紫外光吸取法:A280nm 0.769A A260nm 0.959AA280nm/A260nm1.5,蛋白质含量(mg/ml)=1.45A280nm0.74A260nm =0.405 mg/ml考马斯亮蓝法管号1(空白)23456789标准蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.8样品/ml110.9%NaCl/ml10.90.80.70.60.40.200考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.0
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