实时定量PCR完全手册

1、方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成1、反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA2、扩增:用PCR的方法扩增cDNA3、检测:实时检测和定量扩增的产物RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)1、分析结

2、果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2、反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3、数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。QRT-PCR 抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.存在的问题由于各个学术团体和科研机

3、构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1、.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2、整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3、总RNA或者mRNA4、RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5、不同的酶以及酶的不同组合6、变异系数、灵敏度7、多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。8、每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA 质量评价现在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course () 比较了用Ribogreen, Agilent Bi

4、oAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。RNA 质量RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100

5、也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3：5分析法。我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3;5以及中部。扩增产物的之间的比值

6、反应RNA的完整性。如果3;5的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。是否有抑制物的评价体系：1、通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2、.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3、用细菌检测临床样品的抑制4、通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1、RT和PCR单一酶系统2、RT和PCR分离的酶系统3、RNA逆转录引物的选择引物主要有三种：1、随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物。2、oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对

7、于一些特殊的变异体以及较长的3UTR的区域比较困难3、特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR 优化PCR优化主要有：1、引物的浓度2、建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程:I靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (),PrimerBank ()Real Time PCR Primer Sets ()如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:A、最广泛使用的商业

8、化的软件Beacon Designer()B、DIY的软件Primer ExpressC、如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到D、一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: 您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免

9、引物次级结构和3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。2、输入靶序列，用BLASTn在进行比对。3、检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计。4、在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物

10、非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。5、考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。6、在RT步骤时，用()工具检测在特定温度下靶序列的

11、折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低。7、尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3区域 。实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图)点击次数： 2258  发表于：2008-07-21 01:57转载请注明来自丁香园 来源：互联网 一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧

12、光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线 ：（2） 荧光阈值：（3）Ct值：     CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应

13、：   X=X0*2n非理想的PCR反应：  X=X0 (1+Ex)n      n：扩增反应的循环次数      X：第n次循环后的产物量      X0：初始模板量      Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：分页: 1   2   3

14、   实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图)点击次数： 2258  发表于：2008-07-21 01:57转载请注明来自丁香园 来源：互联网 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位     2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR反应体系的建立及优化:

15、 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、 基因型的分析；3、 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任

16、何DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏； 便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；   对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan-水解型杂交探针 *5端标记有报告基团(Reporter, R)  ，如FAM、VIC等 *3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)* 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点

17、检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，<30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-602、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值  引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性 &

18、#160;      -阴性结果确定设计相对简单       -与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标;委托公司标记，价格较高;不易找到本底低的探针定量PCR常见问题及对策点击次数： 417  发表于：2008-07-20 19:35转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 Q1无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2.检测荧光信号的步

19、骤有误。一般SG法采用72延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。 4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。 5.模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 6.模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Q2CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。 Q3标准

20、曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。 2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针 4模板中存在抑制物，或模板浓度过高 Q4阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。 2.引物二聚体的出现。用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 3.反应过程中探针的降解。用PAGE电泳对探针进行检测。 4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。 Q5在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常

21、陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。 Q6熔解曲线不止一个主峰1引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 2.引物浓度不佳。适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 4.模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。Q7扩增效率低1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 2.反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 3.反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。 Q8实验重复性不好1.加样不准确。 2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度