血清学诊断技术

1、血清学诊断技术 一一 原原 理理 许多病毒具有凝集动物红细胞的能力许多病毒具有凝集动物红细胞的能力, , 这种凝集能这种凝集能力可被相应的抗体所抑制力可被相应的抗体所抑制, , 故可用已知病毒检测相应的血凝故可用已知病毒检测相应的血凝抑制抗体抑制抗体 . . 也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定. .红细胞凝集抑制试验红细胞凝集抑制试验 二二 使用范围使用范围 新城疫、新城疫、禽流感、禽流感、减蛋综合征、减蛋综合征、鸡毒支原体、鸡毒支原体、滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分离后滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分

2、离后的鉴定的鉴定 三三 器材器材1.1.血凝板、血凝板、2.2.微量移液器微量移液器3.3.标准抗原标准抗原 4.1%4.1%红细胞悬浮液红细胞悬浮液 5.5.被检血清被检血清 6.6.稀释液稀释液 四四 操作程序操作程序（一）（一）0.50.5红细胞的准备红细胞的准备 1. 1.阿氏液阿氏液( (抗凝剂抗凝剂) )的配制的配制 葡萄糖葡萄糖1.8661.866 柠檬酸钠柠檬酸钠0.80.8 柠檬酸柠檬酸0.0550.055 氯化钠氯化钠 0.418g 0.418g 蒸馏水蒸馏水 100ml 100ml 混匀放入混匀放入100 ml100 ml葡萄糖瓶内，葡萄糖瓶内，1010磅磅115115度

3、度1010分钟分钟 高压灭菌。冷却后高压灭菌。冷却后44保存备用。保存备用。2.2.采血采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，取健康鸡翅静脉或心脏采血，( (按阿氏液按阿氏液2 2份，血液份，血液1 1份）份）注意注意:(1). :(1). 两只健康的鸡血混合两只健康的鸡血混合; ; (2). (2). 阿氏液的量要够阿氏液的量要够3. 3. 红细胞悬液的配制：红细胞悬液的配制： 将血液注入离心管中，经将血液注入离心管中，经30003000转转/ /分钟，离心分钟，离心5-5-1010分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液

4、（生理盐水）洗涤，再用离心机将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机30003000转转/ /分钟离心分钟离心5-105-10分钟，充去上清液，再加稀释液分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤，洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按胞，按1%1%的稀释度加入稀释液（的稀释度加入稀释液（1 1毫升红细胞泥加毫升红细胞泥加9999毫毫升稀释液）。升稀释液）。( (二二) )被检血清被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经洁净干燥试管内（微量法

5、可用孔经2-32-3毫米塑料管由翅静脉采毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 注意注意: : 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。 ( (三）三） 血凝抗原效价测定血凝抗原效价测定 （操作量（操作量25ul25ul）(1)(1)抗原抗原 一般以鸡新城疫一般以鸡新城疫IIII系或系或LasotaLasota系作为已知抗原。系作为已知抗原。 来源来源: : 1). 1).购买购买: : 目前也有用聚乙二醇使目前也有用聚乙二醇使LasotaLasota系病毒液浓缩，作系病毒液浓缩，作 成稳

6、定浓缩抗原，成稳定浓缩抗原，HAHA效价达效价达1 1：50005000以上，以上，44半年半年 不变。不变。 2) 2) 自制自制: :A. A. 用鸡新城疫用鸡新城疫IIII系或者系或者LasotaLasota系疫苗接种鸡胚制备抗原：系疫苗接种鸡胚制备抗原：B. B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释疫苗用灭菌生理盐水稀释1010倍，以倍，以0.10.1毫升接种于毫升接种于1010日龄的鸡胚日龄的鸡胚尿囊内尿囊内; ;C. C. 凡接种后凡接种后72-12072-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心（鸡胚尿囊液

7、于消毒试管内，如有血细胞应离心（20002000转转/ /分钟）分钟）1515分钟，取上清液分钟，取上清液; ;D. D. 作作HAHA试验，其凝集价在试验，其凝集价在1 1：640640以上的鸡胚鸡，分装于洁净以上的鸡胚鸡，分装于洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。 2.2.抗原血凝价的测定抗原血凝价的测定每种抗原做两排，结果取均值每种抗原做两排，结果取均值 1). 1-12 1). 1-12孔加生理盐水孔加生理盐水25ul25ul 2). 2). 第第1 1孔加抗原孔加抗原25ul25ul，反复吹打，反复吹打1010次吸取次吸取25ul25ul到第到第2

8、 2孔，孔，依此类推倍比稀释至第依此类推倍比稀释至第1111孔孔 3). 3). 最后从第最后从第1111孔吸取孔吸取25ul25ul弃去弃去, ,第第1212孔做生理盐水对照孔做生理盐水对照 4). 4). 所有孔加所有孔加25ul 125ul 1红细胞红细胞 5). 5). 将血凝板振荡将血凝板振荡1 1分钟分钟 6 6 新城疫病毒室温（新城疫病毒室温（18221822）作用）作用 30 30分分; ; 禽流感病毒禽流感病毒3737作用作用3030分分. .夏季结果出现快，冬季较慢夏季结果出现快，冬季较慢 新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱 7 7 结果判

9、定结果判定 1). 1).完全凝集孔为终点完全凝集孔为终点 2). 2).将血凝板成将血凝板成4545角竖立观察角竖立观察 3). 3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集 4). 4).孔底没有红细胞沉淀孔底没有红细胞沉淀, ,红细胞均匀平铺于孔底为凝红细胞均匀平铺于孔底为凝集集, ,此孔稀释倍数为此孔稀释倍数为1 1个工作单位个工作单位孔孔 号号1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀释倍数稀释倍数5 5101020204040808016016032032064064012801280对照对照生理盐水（毫升）生理盐水（毫升）病毒液（毫升）病毒液（

10、毫升）4 4* *1 125252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525(25)(25)弃去弃去生理盐水（毫升）生理盐水（毫升）25252525252525252525252525252525252525250.5%0.5%红细胞液红细胞液（毫升）（毫升）2525252525252525252525252525252525252525作用温度与时间作用温度与时间混合均匀置混合均匀置18221822作用作用45604560分钟，对照管出现结果时判定分钟，对照管出现结果时判定结果（举例）结果（举例）+ +- -

11、 -鸡新城疫红细胞凝集试验（鸡新城疫红细胞凝集试验（HAHA试验）试验） ( (过程图过程图) )注意注意 能使鸡红细胞完能使鸡红细胞完全凝集的病毒液全凝集的病毒液的最高稀释倍数，的最高稀释倍数，称为该病毒液的称为该病毒液的红细胞凝集效价。红细胞凝集效价。如上例，病毒病如上例，病毒病的的HAHA效价为效价为1 1：320320。 （四（四) ) 红细胞凝集抑制试验红细胞凝集抑制试验 1. 抗原准备（工作浓度的准备 ） 红细胞凝集抑制试验（红细胞凝集抑制试验（HIHI试验）时，病毒抗原液试验）时，病毒抗原液2525ul内需含内需含4 4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成个凝集单位，所以，应将原

12、菌抗原毒作成320/4=80320/4=80倍稀释。倍稀释。 2 2 操作步骤操作步骤 (1) (1) 每孔加每孔加25ul25ul的稀释液的稀释液: :(2)(2) 第第1 1孔加孔加25ul25ul待检血清，反复吸吹待检血清，反复吸吹1010次次; ; 吸取吸取25ul25ul于第于第(3)(3) 2 2孔，以此类推倍比稀释至第孔，以此类推倍比稀释至第1111孔孔; ; 最后从第最后从第1111孔取孔取2 2 (4)(4) 5ul 5ul弃去弃去, ,第第1212孔为抗原对照孔为抗原对照; ;(3) (3) 每孔加每孔加4 4单位抗原单位抗原; ;室温下室温下( 18-22)( 18-22

13、)作用作用3030分分(4) (4) 取取1 1红细胞红细胞25ul25ul加于各孔中加于各孔中(5) (5) 将血凝板振荡将血凝板振荡1 1分钟分钟(6) (6) 室温作用室温作用30-4530-45分钟（禽流感分钟（禽流感 37 37）观察结果）观察结果(7) (7) 结果判定结果判定 将血凝板呈将血凝板呈4545竖起观察竖起观察 完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉, ,此孔为抑制终点此孔为抑制终点. .鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（H试验）试验） (过程图过程图)孔孔 号号1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010稀释倍

14、数稀释倍数对照对照生理盐水生理盐水待检血清待检血清25252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525252525(25)(25)弃去弃去4 4单位抗原单位抗原25252525252525252525252525252525252525250.5%0.5%红细胞红细胞液（毫升）液（毫升）2525252525252525252525252525252525252525作用温度与作用温度与时间时间混合均匀置混合均匀置18-2218-22作用作用45-6045-60分钟，对照管出现结果时判定分钟，对照管出现结果时判定结果结果放室

15、温作用分钟单位：l 3. 3.结果报告结果报告(1).(1).鸡的免疫临界水平。鸡的免疫临界水平。(2).(2).鸡群的鸡群的HIHI抗体水平是以抽检样品的抗体水平是以抽检样品的HIHI抗体效价（抗体效价（log2log2） 的平均值表示的。的平均值表示的。(3).(3).检样中检样中HIHI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。(4).(4).大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1%-0.5% 0.1%-0.5%，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为 理想的抽

16、样率应为理想的抽样率应为2%2%。(5(5）. .鸡群接种新城疫疫苗后，经鸡群接种新城疫疫苗后，经2-32-3周测血清中的周测血清中的HIHI抗体效抗体效 价若提高价若提高2 2个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种 成功；若成功；若HIHI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。抗体效价无明显提高，表示免疫失败。琼脂免疫扩散试验（琼脂免疫扩散试验（AGPAGP） 一一 原理原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中, ,可以向四周扩可以向四周扩散散, ,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合当抗原抗体扩散到适当比列处相结合, ,出现肉

17、眼可见的出现肉眼可见的沉淀线沉淀线. . 常用已知抗原检测相应的抗体常用已知抗原检测相应的抗体二二 适用范围适用范围( ( 琼脂扩散试验适用琼脂扩散试验适用) )禽流感、禽流感、传染性支气管炎传染性支气管炎传染性法氏囊病、传染性法氏囊病、传染性喉气管炎传染性喉气管炎鸡痘、鸡痘、马立克氏病、马立克氏病、传染性脑脊髓炎传染性脑脊髓炎网状内皮组织增生症、网状内皮组织增生症、病毒性关节炎病毒性关节炎多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。三三 器材器材琼脂扩散板（平皿）琼脂扩散板（平皿）; ;打孔器、打孔器、 移液器移液器;0.01M PH 7.2 ;0.01M PH 7.2 的的磷酸

18、缓冲液磷酸缓冲液; ;琼脂粉（糖）琼脂粉（糖） 四四 操作程序操作程序（一）琼脂板制备（一）琼脂板制备1琼脂粉1g磷酸盐缓冲液100ml2加热煮沸，摇动烧瓶使琼脂粉溶解3加入8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解，4待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度为2.53mm5琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4保存备用（二）（二） 打孔打孔 1用打孔器按7孔梅花图案打孔孔径为3mm-4mm,孔距为3mm大平皿可打六组梅花孔2打孔后用7#针头挑出孔内琼脂3最后在酒精灯上烧烤封底（三）（三） 加样加样 1 中间孔加抗原中间孔加抗原 2 外周孔加血清外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清孔加阳性血清; 其他其他 孔加待检血清孔加待检

19、血清; 加样至满孔为止加样至满孔为止; 3 室温下放置室温下放置1020分钟分钟 使孔内液体扩散完毕或液面下降使孔内液体扩散完毕或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内将琼脂板倒置于湿盒内 37温箱内作用温箱内作用24-72小时观察结果小时观察结果 五五 结果判定结果判定 （ 一 ）（ 一 ） 当 阳 性 血 清 与 抗 原 孔 之 间 出 现 清 晰 沉 淀 线当 阳 性 血 清 与 抗 原 孔 之 间 出 现 清 晰 沉 淀 线 证明实验成立证明实验成立 （二）（二） 如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳或阳 性性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被

20、检血清判为阳性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为阳性 （三）（三） 如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线; ;而且阳性血而且阳性血清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性血血 清清 平平 板板 凝凝 集集 试试 验验 一一 原理原理 细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合, ,在适当的电解质在适当的电解质参与下参与下, , 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可见团经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可见团快快. . 常用已知细菌性抗原检测相应的凝集抗体常用已知细菌性抗原检测相应

21、的凝集抗体 凝集试验包括：试管凝集反应凝集试验包括：试管凝集反应 、平板凝集反应全血平、平板凝集反应全血平板凝集反应、血清平板凝集反应）板凝集反应、血清平板凝集反应）. .二二 适用范围适用范围鸡白痢、鸡伤寒鸡毒支原体、滑液囊支原体鸡副嗜血杆菌病（鸡传染性鼻炎） 三三 器材器材 凝集抗原、阳性、阴性血清凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器（被检血清，移液器（550ul） 载玻片，载玻片，25灯箱灯箱 四四 操作程序操作程序 （一）（一）准备准备 试验前试验前20分钟自分钟自4冰箱取出抗原冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清阴、阳性血清和被检血清; 使其达到室温，并将抗原液振荡均匀使其达

22、到室温，并将抗原液振荡均匀 （二）试验过程（二）试验过程 1. 取抗原液取抗原液25ul滴于载玻片上滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀快速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成并涂布成 2cm大小的片状大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察有无分钟，观察有无凝集凝集五五 结果判定结果判定2 2 分钟内出现明显凝集（背景透亮）为阳性分钟内出现明显凝集（背景透亮）为阳性; ;背景均匀一致背景均匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性呈混浊样，无凝集者为阴性. . 阴性阳性鸡白痢沙门氏菌的

23、平鸡白痢沙门氏菌的平板凝集试验的观察板凝集试验的观察新城疫病毒、新城疫病毒、禽流感病毒的分离和鉴定禽流感病毒的分离和鉴定 一一 病料的采集和处理病料的采集和处理活动物：气管、喉头、呼吸道分泌物（拭子）死动物：肝、脾、肺等内脏用生理盐水（肉汤）（含双抗2000单位/ml）制成12组织匀浆4冰箱作用小时或过夜转分离心分钟取上清液备用 二 鸡胚接种鸡胚接种1取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚2取上述处理的上清液0.2ml接种于鸡胚尿囊腔中337培养4-7天4每天照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚5收集死胚及培养结束时的活胚放4冰箱中冷却2小时以上（过夜）6收取尿囊液测定其HA活性（效价

24、）阴性者需传代2次三三 病毒鉴定病毒鉴定禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒以及某些细菌支原体也具有血凝性可用相应特异阳性血清进行血凝抑制试验或全血平板凝集抑制试验进行鉴定新城疫血凝抑制试验禽流感琼脂扩散试验不同血清型禽流感血凝抑制试验 四四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定（一）（一） 鸡胚平均致死时间（鸡胚平均致死时间（MDTMDT）（最小致死量）（最小致死量） 1 1 将新鲜感染尿囊液进行将新鲜感染尿囊液进行10101 1-10-109 9稀释稀释 2 2 每个稀释度接种每个稀释度接种5 5枚枚911911天天 SPF SPF鸡鸡0.1ml/0.1ml/胚

25、胚 3 3 置置3737培养。每日照蛋培养。每日照蛋2 2次次 4 4 连续观察连续观察7 7天，记录每个鸡胚死亡时间天，记录每个鸡胚死亡时间 最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度 MDT MDT最小致死量引起鸡胚死亡平均时间最小致死量引起鸡胚死亡平均时间 强强 毒毒6060小时小时 中等毒力中等毒力61-9061-90小时小时 低等毒力低等毒力9090小时小时 （二）（二） 脑内致病指数（脑内致病指数（IICP） 1、取凝集价在、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液以上的新鲜感染尿囊液 用生理盐水用生理盐水10倍稀倍稀释；释； 2、脑内接种、脑内接种1日

26、龄雏鸡（日龄雏鸡（24-40小时）小时） 10只，只， 每每只只0.05ml； 3、 每每24小时观察一次，共观察小时观察一次，共观察8天；天； 4、 每天观察给鸡打分，正常鸡为每天观察给鸡打分，正常鸡为0分；分； 病鸡为病鸡为1分；死鸡为分；死鸡为2分；鸡每天观察仍记录分；鸡每天观察仍记录2分）分） IICP是每只鸡是每只鸡8天所有观察数值的平均数强毒力病毒天所有观察数值的平均数强毒力病毒ICPI为为2，温和，温和毒数为毒数为0 (三）三） 静脉致病指数（静脉致病指数（IVPI） 1 将将HA高于高于24的新鲜感染尿囊液的新鲜感染尿囊液 用生理盐水做用生理盐水做10倍倍稀释稀释 2 给给10只只6周龄周龄SPF鸡静脉接种鸡静脉接种0.1ml 3 每天观察一次，共每天观察一次，共10天，每次观察记录正常鸡为天，每次观察记录正常鸡为0，病鸡病鸡1， 瘫痪鸡、有神经症状者为瘫痪鸡、有神经症状者为2， 死鸡记作死鸡记作3（死鸡以后每天仍记（死鸡以后每天仍记3） IVPI指每只鸡