蛋白质浓度测定方法研究进展

1、蛋白质浓度测定方法蛋白质浓度测定方法目录目录1 1经典方法经典方法2 2新的方法新的方法3 3测定方法的选择测定方法的选择前言前言难点背景u蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容u是临床诊断疾病及检查健康情况的重要指标u也是很多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标意义u这些分析方法需要一个合适的标准蛋白或者其组成氨基酸的序列信息以便准确估计目的蛋白浓度u在蛋白质分离纯化过程中，测定蛋白质的浓度是一个很重要的环节，可以帮助人们计算产率、进行物质平衡或测定靶蛋白的特定活力/效力。缺少这一技术的辅助，我么就无法明确得知某种蛋白质的存在，也就无法完成分离提纯的最终目的。1 1 经

2、典方法经典方法1.1 1.1 凯式定氮法凯式定氮法原理原理绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在1517%，平均值为16%左右。只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。CuSO4 作催化剂；作催化剂；K2SO4 提高溶液的沸点提高溶液的沸点消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中用标准盐酸溶液进行滴定，记录，计算出样品含氮量高温条件下强酸(浓H2SO4)把样品中的蛋白质的有机氮全部消化为无机氮形式1.1 1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法结果计算结果计算只含蛋白质若测定的

3、样品含氮部分只是蛋白质：样品中蛋白质含量（样品中蛋白质含量（%）=总氮量总氮量 6.25若样品中尚含有其他含氮物质，则需加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量：蛋白氮蛋白氮 = 总氮总氮 - 非蛋白氮非蛋白氮 蛋白质含量（蛋白质含量（%）= 蛋白氮蛋白氮 6.25含氮杂质1.1 1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法三鹿奶粉事件三鹿奶粉事件化学式： C3N6H6分子量：126含氮量：66.6% 鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质 三聚

4、氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，参入会容易被检测出来牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因为它能冒充蛋白质 三聚氰胺三聚氰胺1.2 1.2 双缩脲法双缩脲法(Biuret(Biuret法法) )原理原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。紫色络合物紫色络合物双缩脲双缩脲凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。1.2 1.2 双缩脲法双缩脲法操作步骤操作步骤绘制标准曲线测定待测

5、溶液A540对照标准曲线计算浓度在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。测定范围为110mg蛋白质。试剂试剂(ml)管号管号空白管空白管 12345测定管测定管蛋白标准液（蛋白标准液（10g/L） -0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -生理盐水生理盐水0.50.4 0.3 0.2 0.1 -0.4待测样品待测样品-0.1双缩脲试剂双缩脲试剂3.03.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0相当蛋白质（相当蛋白质（g/L）01020304050 1.3 1.3 紫外吸收法紫外吸收法原理原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯

6、丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。1.3 1.3 四种紫外吸收法四种紫外吸收法 280nm280nm的光吸收法的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。绘制标准曲线测定待测溶液A280对照标准曲线计算浓度 280nm280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，其吸收高峰在260nm附近

7、。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5 对于含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度： 蛋白质浓度 (mg/ml) = 1.45A2800.74A260 215nm215nm与与225nm225nm的吸收差法的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 肽

8、键测定法肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。1.4 Folin-1.4 Folin-酚试剂法酚试剂法原理原理又叫Lowry法。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。这种方法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。Pr.+ CuPr.+ Cu2+2+Cu-ProteinCu-ProteinBlue ProductBlue ProductOHOH- -磷钼酸磷钼酸磷钨酸磷钨酸在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复

9、合物Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）1.4 Folin-1.4 Folin-酚试剂法酚试剂法操作步骤操作步骤试剂（试剂（ml）管号管号O12345测定管测定管标准蛋白溶液（标准蛋白溶液（250g/ml）0.20.40.60.81.0待测溶液待测溶液1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2碱性铜试剂碱性铜试剂5.05.05.05.05.05.05.0混匀，室温放置混匀，室温放置20min酚试剂酚试剂0.50.50.50.50.50.50.5721分光光度计，波长分光光度计，波长750nm，记录吸光度值，记录

10、吸光度值进行测定时，加酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性进行测定时，加酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原条件下稳定，但上述还原反应只在反应只在pH=10的情况下发生，故当酚试剂加到碱性的铜的情况下发生，故当酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。绘制标准曲线 四种经典方法的比较四种经典方法的比较方法方法灵敏度灵敏度时间时间原理原理干扰物质干扰物质说明说明凯氏定氮法灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮，误差为2%费时。

11、8-10h将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定。非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离。用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少，费时太长。双缩脲法灵敏度低，1-20mg。中速。20-30min多肽键碱性Cu2+ 紫色络合物。硫酸铵：Tris缓冲液；某些氨基酸。用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似。紫外吸收法较为灵敏，50-100mg。快速。5-10min蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收。各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸。用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正。Folin-酚试剂法灵敏度高，5mg。中速。40-60min碱性下肽键与Cu2+生成复合物，还原磷钼酸-磷钨酸试剂生成蓝

12、色化合物，在750nm处光吸收峰。酚类，硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，甘油，糖类，柠檬酸。应用最广泛，耗时较长，需精准把握时间，标准曲线不是严格直线形式，干扰物质较多，专一性差。2 2 新的方法新的方法2.1 2.1 考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（BradfordBradford法）法）原理原理考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。2.1 2.1 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法2.2 BCA2.2 BCA比色法比色法原理原理碱性条件下，蛋白将Cu

13、2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂（4，4-二羧酸-2，2-二喹啉钠）形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。2.2 BCA2.2 BCA比色法比色法操作步骤操作步骤这种方法的突出优点是：1.准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml。2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。3.经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。4.检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝。混合混合BC

14、ABCA工作试剂工作试剂（试剂（试剂A A：试剂：试剂B B=50=50：1 1）充分混合充分混合 （0.1mL样品样品+工作试剂）工作试剂）温育：温育：37,30min.然后冷却然后冷却分光光度计分光光度计 562nm读吸光度读吸光度2.3 2.3 荧光淬灭法荧光淬灭法 原理原理采用荧光法测定蛋白质含量，当溶液中含有表面活性剂时，荧光染料分子之间通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体，导致荧光强度降低，加入蛋白质溶液导致多聚体解聚而使荧光强度增加，随着蛋白质溶液浓度的增加，荧光强度逐渐降低。 荧光淬灭原因：这可能是由于表面活性剂存在下蛋白质聚集成超分子结构时包裹了FITC导致FITC荧光被淬灭,

15、从而表现出随着蛋白质溶液浓度增加而出现荧光强度下降的现象。2.3 2.3 荧光淬灭法荧光淬灭法操作步骤操作步骤在酶标板每孔中加入50L稀释后的FITC(异硫氰基荧光素)缓冲溶液，再分别加入50L浓度为10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液，混合均匀后静置5min再进行测定，每个浓度水平平行分析3次取平均值。仪器参数设定如下:振荡30s，激发波长488nm，发射波长530nm，每孔取25次读数的平均值，积分时间20s，测定温度37.0。3 3 测定方法的选择测定方法的选择第一章 吉满杯的简单介绍可

16、检测范围内的样品体积可达到最好的灵敏度和动态范围，尤其是对于荧光分析法。膜蛋白或容易聚合的蛋白质经常会产生溶解问题，使得最后测定达不到预期的结果。共价修饰蛋白，比如糖基化和PEG化的蛋白会干扰某些方法的测定。如果要同时测定多个样品，选择微孔板分析可以一次性完成，更加高效。如果样品量是很有限，选择非破坏性的方法，比如紫外吸收法可能更合适。开始：蛋白样品蛋白溶液不含有干扰性物质所有方法均可选择BSA、IgG做标准蛋白，避免使用Bradford法、amine derivatization法避免使用Bradford法、Lowry法避免UVAbs280nm、Bradford法硫醇或还原性试剂存在e.g.

17、 DTT避免BCA法、Lowry法螯合剂存在，e.g. EDTA避免BCA法、Lowry法洗涤剂存在，e.g. 用于蛋白溶解检查洗涤剂兼容性数据用于沉淀的高浓度盐、酸存在检查BCA、 Lowry Bradford兼容性数据溶液中有胺或铵离子避免BCA、 Lowry、amine derivatization法有合适的参考标准蛋白游离蛋白而非翻译后修饰蛋白（糖基化）蛋白MW8 kDa 含有多个Tyr/Trp 否否否否是 是 是 是 是 是 是 是 是 干扰性物质的兼容浓度干扰性物质的兼容浓度Conclusion2nd priority initiatives12345Evaluate whether offer DT store more margin is possibleTogether with other strong brand