补充左旋精氨酸对耐力训练大鼠股外肌抗氧化酶系的影响

1、补充左旋精氨酸对耐力训练大鼠股外肌抗氧化酶系的影响张漓 徐建方 冯连世 封文平国家体育总局体育科学研究所运动生物科学中心(北京100061摘要 目的:研究补充左旋精氨酸(L-Arg对耐力训练大鼠股外肌抗氧化酶系的影响,了解一氧化氮及其自由基衍生物对耐力训练机体骨骼肌自由基生成和清除的作用。方法:通过适应性训练筛选出40只SD雄性大鼠,按体重随机分为:安静对照组、耐力训练组、小剂量+耐力训练组、大剂量+耐力训练组,每组10只。除安静对照组外其他动物进行了4周水平跑台耐力训练,小剂量+耐力训练大鼠和大剂量+耐力训练大鼠分别在每次训练前一小时左右按照40mg/kg体重的剂量和500mg/kg体重的剂

2、量给予L-Arg水溶液灌胃;4周训练后测定各组大鼠股外肌丙二醛(MDA含量、过氧化氢酶(C AT、超氧化物歧化酶(SOD、谷胱甘肽转移酶(GST的活性,以及血清肌酸激酶(C K活性。结果:(1耐力训练对大鼠安静状态下股外肌C AT活性没有影响;给予小剂量L-Arg能使耐力训练大鼠安静状态下股外肌C AT活性显著降低(P<0 01,给予大剂量L-Arg反而使CAT活性回升;(2耐力训练对大鼠安静状态下股外肌SOD活性没有影响,补充L-Arg可使大鼠股外肌SOD活性明显升高(小剂量P<0 01,大剂量P<0 05;(3耐力训练可使大鼠安静状态下股外肌GST活性显著下降(P<

3、0 01,补充L-Arg则使其下降不明显(P>0 05;(4耐力训练能够使安静大鼠股外肌MDA和血清CK显著减少(P<0 05,补充L-Arg会增加经过耐力训练的大鼠安静状态下股外肌MDA生成(P<0 01,但血清C K浓度则下降,并且下降趋势随补充L-Arg剂量增加而增加。结论:在耐力运动中NO能够促进骨骼肌内超氧化物自由基及其衍生物自由基的生成,较高浓度的NO还能够促进过氧化氢、过氧化物和脂质氢等自由基的生成,对骨骼肌有一定的自由基损伤作用。但其上调血流量的保护作用能够部分抵消其带来的自由基损害作用。关键词 耐力训练;大鼠;L-Arg;一氧化氮;抗氧化酶Effect of

4、 Supplementation of Exogenous L-Arg on the Antioxidant Enzymes in Vastus Lateralis ofRats undergoing Endurance TrainingZhang Li,Xu Jian fang,Feng Lianshi,Feng WenpingCenter o f Biological Science,China Institute o f Sport Science,Beijing,China100061Abstract Objective The present study aimed at inves

5、tigating the effects of nitric oxide(NOand its free radical ramifications on the activities of antioxidant enzymes in the skeletal muscle of rats undergoing en-durance training.Methods After beforehand training,40male SD rats were chosen and randomly divided into 4groups in according to the training

6、 perfor mance and body weights:(1sedentary group(SG;(2en-durance training group(E TG;(3endurance training with low dose of L-Arg group(LDTG;and(4en-durance training with high dose of L-Arg group(HDTG.All rats except the SG under went4weeks of en-durance training on treadmill.The LDTG was given40mg/k

7、g wt of L-Arg,and the HDTG group was given 500mg/kg wt of L-Arg1hour before training of each day.All rats were killed24hours after the final train-ing.The MDA,CAT,SOD and GST activities in vastus lateralis,and serum CK activity were determined.Results(1The CAT activity in SG remained unchanged,while

8、 decreased significantly in LDTG(P<0 01,基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号30570892通讯作者:张漓,Email:zhanglici ;Tel:010-*and sho wed some trend of increasing in HDTG.(2SOD activity remained unchanged in E TG,ho wever,in-creased significantly in LD TG(P<0 05and HDTG(P<0 01.(3GST activity decreased significant

9、ly in ETG(P<0 01,but showed no change in groups with supplementation of L-Arg.(4Endurance training reduced MDA production and serum C K level in SG significantly(P<0 05.The production of MDA in-creased in groups with supple mentation of L-Arg.Ho wever,serum CK decreased while the dose of L-Arg

10、 increased.Conclusions The damaging effect of nitric oxide as a free radical appeared mainly through increasing the production of superoxide radical and its ramification.High level of NO could also increase the output of free radicals such as peroxide,hydro peroxide and lipoxide hydrogen,and hence a

11、ggravate the damage of the skele-tal muscle.But it s free radical damage effects can be partly mitigated by its upgrade-blood-stream effec ts.Key words rat,nitric oxide,antioxidant enzymes,endurance training,L-ArgNO本身是一种自由基,与超氧化物自由基结合后还会形成化学活性远高于NO或超氧化物自由基的物质ONOO-1,2,后者可以与CO2结合成高活性物质,还可以通过均裂反应成为自由基与

12、非自由基3。其中,自由基衍生物ONOO-的活性作用是目前已知生物自由基里活性最高的自由基之一,能够通过破坏线粒体结构的完整性,诱导线粒体膜通道开放,可逆或不可逆地抑制一些线粒体呼吸链的中间反应,损伤DNA,增强表达P53等作用导致细胞抑制或凋亡4,因此NO作为自由基在人体内发生的病理作用不容忽视,值得深入探讨。许多研究都报道过生理浓度的NO对组织细胞有保护作用,高浓度的NO则有促进细胞凋亡的作用5,6,目前国内外对NO在脑缺血再灌注中对神经元细胞的损伤作用的研究很多7,而对NO的自由基作用对骨骼肌细胞的损伤研究则少见。我们在前期研究中发现,补充左旋精氨酸(L-Arg可以提高机体内NO的生成量,

13、同时增加对骨骼肌的损伤8,其中是否有关联还未见相关报道。本研究期望通过给予耐力运动大鼠外源性L-Arg来提高运动大鼠体内NO生成量,进而观察NO作为自由基物质对大鼠骨骼肌及骨骼肌抗氧化酶系带来的影响,从而为证实运动中NO作为自由基具有损伤骨骼肌的作用提供依据。1 材料与方法1 1 研究对象与筛选分组实验对象:雄性SD大鼠50只(购自中国医学科学院实验动物中心,鼠龄6周,自由饮食,室温18 2 ,光照时间7 00-19 00。动物筛选与分组:所有实验大鼠进入动物房进行适应性生活5天,适应性跑台训练9天,随后进行一次耐力性力竭运动,根据力竭运动时间筛选出耐力运动能力最接近的40只大鼠,按体重随机分

14、成4组:安静对照组(Sedentary Group,SG,n=10,体重295 28 9 61g;(2耐力训练组(Endurance Training Group,E TG,n=10,体重296 82 6 35g;(3小剂量+耐力训练组(Low Dose Training Group,LD TG,n=10,体重295 28 7 82g;(4大剂量+耐力训练组(High Dose T raining Group,HDTG,n=10,体重296 03 8 92g。1 2 运动方式与给药情况运动方式:除安静对照组外其他各组动物进行4周水平跑台耐力训练,速度36米/分、运动时间为60分钟/日,每周训练

15、6天,休息1天,运动中使用电刺激大鼠尾部。给药情况:小剂量+耐力训练组大鼠每次训练前1小时左右按照40mg/kg体重的剂量给予浓度10g/L的L-Arg水溶液灌胃;大剂量+耐力训练组大鼠每次训练前1小时左右按照500mg/kg体重的剂量给予浓度125g/L的L-Arg水溶液灌胃。1 3 实验取材各组大鼠均在4周耐力训练跑结束24小时后处死取材。按1 0ml/100克体重剂量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠,腹主动脉取血,然后迅速分离出大鼠右侧股外肌(股四头肌外侧头,投入液氮中保存待用。取出的主动脉血待静置30分钟后3000转/分离心10分钟,分离出血清保存待用。1 4 测试指标与方法1

16、4 1 股外肌丙二醛(MDA含量,和过氧化氢酶(C AT、超氧化物歧化酶(SOD、谷胱甘肽转移酶(GST、一氧化氮合酶(NOS活性的测定肌肉用生理盐水制备成10%的匀浆,3500转/分,离心20分钟,取上清液测定各指标。MDA测试利用MDA与硫代巴比妥酸缩合形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰的原理,组织MDA含量用nmol/mg prot表示;C AT利用可见光法测试,C AT活力定义是每毫克组织蛋白每秒钟分解1 mol的H2O2的量为一个活力单位;SOD测试采用黄嘌呤氧化酶法,活力定义是每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位;GST测试

17、采用可见光法,活力定义是每毫克蛋白质每分钟扣除非酶促反应使GSH浓度降低1 mol/L为一个酶活力单位。NOS活性通过测定单位体积血清或单位重量组织蛋白质在单位时间内生成NO的nmol数来测定。组织蛋白质浓度采用双缩脲法测定。上述指标均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒以及MD-100半自动生化分析仪测定,具体方法全部参照试剂盒附带的说明书进行操作。1 42 血清肌酸激酶(CK血清C K活性测定采用上海生工公司提供的试剂盒,以及MD-100半自动生化分析仪测定,具体方法全部参照试剂盒附带的说明书进行操作。1 5 数据处理所有实验数据均以算术平均数 标准差表示,用SPSS11 0软件对各组的

18、实验结果分别进行t检验,P<0 05为具有显著性意义,P<0 01为具有非常显著性意义。2 结果2 1 大鼠股外肌NOS及抗氧化酶活性变化表1显示,耐力训练组和大剂量+耐力训练组较安静对照组NOS活性显著下降(P<0 01,但小剂量+耐力训练组和大剂量+耐力训练组均显著高于耐力训练组(P<0 01。耐力训练组股外肌SOD与安静对照组相比无明显变化,补充L-Arg的训练组SOD活性明显升高(小剂量P<0 01,大剂量P<0 05,小剂量+耐力训练组显著高于耐力训练组,大剂量+耐力训练组与耐力训练组相比有升高趋势,但无统计学意义。耐力训练组股外肌C AT活性与安

19、静对照组相比无明显差异,给予小剂量L-Arg后C AT活性显著下降(P<0 01,给予大剂量L-Arg后C AT活性反而回升。经过耐力训练后大鼠股外肌GST活性较安静对照组显著下降(P<0 01,而给予L-Arg后GST 活性有回升趋势,小剂量+耐力训练组明显高于耐力训练组(P<0 05,大剂量+耐力训练组虽与耐力训练组相比没有统计学差异,但也有升高趋势。耐力训练能够使股外肌MDA水平显著减少(P<0 01;补充L-Arg则增加耐力训练大鼠股外肌MDA生成(P<0 05。表1 各组大鼠股外肌NOS及抗氧化酶活性的比较Table1 Comparison of NOS

20、 acti vity and antioxidant enzymes in vastus laterali s in each group 组别(Groupsn NOS(U/mg protSOD(NU/mg protC AT(U/mg protGS T(U/mg protMDA( mol/g prot安静对照组(SG100 07 0 0197 57 8 996 93 1 5636 87 12 840 57 0 13耐力训练组(E TG100 01 0 00*102 90 8 367 40 1 5514 48 6 82*0 32 0 09*小剂量+耐力训练组(LD TG100 05 0 02#1

21、15 13 10 25*#4 53 0 86#28 31 12 26#0 58 0 16#大剂量+耐力训练组(HDTG100 04 0 01*#110 99 13 22*8 02 1 14 23 16 10 320 46 0 09#*P<0 05,*P<0 01,与安静对照组比较;#P<0 05,#P<0 01,与耐力训练组比较; P<0 01,与小剂量+耐力训练组比较。*P<0 05,*P<0 01,vs.SG;#P<0 05,#P<0 01,vs.ETG; P<0 01vs.LDTG.2.2 大鼠血清CK的变化表2 各组大鼠血清C

22、K的比较(U/LTable2 Comparision of level of serum C K in each group(U/L组别(Groupsn血清CK安静对照组(SG10934 88 228 12耐力训练组(E TG10712 90 144 61*小剂量+耐力训练组(LDTG10664 38 219 77*大剂量+耐力训练组(HD TG10562 67 116 53*# *P<0 05,*P<0 01,与安静对照组比较;#P< 0 05,与耐力训练组比较。*P<0 05,*P<0 01,vs.SG;#P<0 05,vs.E TG.表2显示,耐力训练

23、组、小剂量+耐力训练组和大剂量+耐力训练组大鼠血清C K水平均较安静对照组显著下降(P<0 05,P<0 01,而且随着给予L -Arg剂量的增加,这种下降趋势更为明显,表现为小剂量+耐力训练组血清CK数值低于耐力训练组,而大剂量+耐力训练组进一步下降,并且较耐力训练组有显著性差异(P<0 05。3 讨论3 1 补充不同剂量L-Arg对大鼠骨骼肌NO/NOS 系统的影响NO在体内寿命极短,只存在几秒到几十秒,其生成水平主要由NOS(一氧化氮合酶的活性决定。从实验结果来看(表1,补充不同剂量L-Arg组股外肌NOS活性均比未补充L-Arg组(耐力训练组明显升高,说明外源性的L-

24、Arg能够提高大鼠股外肌NO生成量。这是因为NO的合成除取决于胞浆内NOS活性外,还与血浆中L-Arg含量和L-Arg 的跨膜转运速率等密切相关。有研究报道耐力训练能够上调大鼠股外肌及其血管壁细胞NOS表达9,还有报道运动锻炼有促进L-Arg跨膜转运的作用,因此这也是运动加补充L-Arg能够提高NO生成能力的原因之一10。本研究拟通过观察增加大鼠股外肌NO生成对抗氧化酶系的影响,来分析NO对股外肌的自由基损伤作用。3 2 耐力训练和补充不同剂量的L-Arg对大鼠骨骼肌抗氧化酶的影响本实验结果显示(如表1,经过一般的耐力训练后,大鼠股外肌SOD活性没有发生变化,而补充L-Arg能提高SOD的活性

25、。James等报道11,有氧耐力训练1619周后雌性豚鼠动脉血管内皮细胞中SOD-1蛋白水平和Cu/Zn-SOD活性显著上升,等等。这与我们的研究结果稍有差异,可能是实验动物及训练负荷不同造成的。超氧化物歧化酶(SOD是有机体内主要清除超氧化物自由基的酶,除了氧自由基外SOD还可以清除氮自由基。通过同时参与调节体内NO水平和O 2水平,SOD可以防止氧、氮自由基对机体造成直接或间接的损伤12。因此补充L-Arg后股外肌SOD活性提高表明NO 具有明显的超氧化物自由基特征。另外,Fukai 等13发现NO可以上调血管细胞外SOD(ec SOD的表达水平,从而防止O 2与NO结合成化学活性很强的O

26、NOO-。因此可以认为给予外源性L-Arg增加NO生成是通过在基因表达水平影响SOD酶蛋白的生成而引起SOD活性的提高。本研究发现耐力训练对大鼠安静状态下的股外肌C AT活性无明显影响,补充小剂量L-Arg可使耐力训练后股外肌CAT活性显著降低,而补充大剂量L-Arg则对C AT活性影响不大(表1。由于C AT 主要清除线粒体产生的过氧化氢(H2O212,因此说明补充小剂量L-Arg可能有助于减少线粒体H2O2的产生,这种作用可能是通过促进骨骼肌供血供氧而达到的。但NO生成量过多不但不能有效降低H2O2的生成,反而有增加H2O2生成的作用,可能是由于NO与超氧阴离子O 2结合后分解释放出氧化性

27、更强的自由基OH ,两个OH 可反应缩合生成H2O2(OH +OH H2O2,H2O2的增加进而引起CAT适应性提高。实验结果提示少量增加NO生成量有利于减少H2O2自由基对股外肌的损伤,大量增加NO生成量则会增加其自由基损伤作用。这与NO在低浓度时主要发挥生理作用,在高浓度时细胞损害作用增强的生理特征是一致的10。本实验结果(表1显示,耐力训练后大鼠股外肌GST活性明显下降,补充L-Arg后股外肌GST活性下降程度反而减小。这是因为谷胱甘肽转移酶主要参与清除机体内脂质氢、过氧化物(包括H2O2,减轻有机氢过氧化物对机体的损害14,而耐力训练能显著降低大鼠股外肌脂质氢、过氧化物等自由基的生成(

28、如前所述,因此训练后GST活性明显下降。而补充L-Arg后NO生成增加,其主要衍生物ONOO-自由基活性很强,可以氧化GSH,使后者成为GSSG,还可引发脂质过氧化、氧化蛋白质及羟化作用,使脂质氢等自由基生成增加,因此能够激活GST,使其活性提高。总的来看,NO生成增加对目前我们熟知的一些主要抗氧化酶活性均有影响,而且有明显的剂量-效应差异。3 3 耐力训练和补充不同剂量的L-Arg对大鼠骨骼肌过氧化物生成的影响为了解NO对运动机体自由基生成和清除的总体影响,我们测定了大鼠股外肌丙二醛(MDA以反映NO的自由基作用对组织细胞膜的损伤程度。血清C K是目前用于评价骨骼肌细胞膜损伤状况的最常用的敏

29、感指标之一,而且影响因素相对较少;我们也测定了血清CK来评估骨骼肌细胞膜的整体损伤程度。本实验结果显示(表1,耐力训练能够显著降低大鼠股外肌MDA生成,而补充不同剂量L-Arg 均能增加经过耐力训练大鼠股外肌MDA水平。王长春等也曾报道过,18天的游泳训练可以使大鼠骨骼肌MDA含量下降15,这个结果和本实验一致,表明耐力训练后机体自由基生成减少和/或消除自由基能力提高。而补充L-Arg能够增加MDA生成,说明在肌肉内NO的自由基损伤作用的确不容忽视。血清CK测试结果与MDA不同(表2:耐力训练后机体血清CK有降低的趋势,这与MDA变化一致;但补充L-Arg后血清C K继续显著下降,并且这种趋势

30、随L-Arg剂量增加而更明显,说明NO生成增加虽然增加了自由基损伤作用,但同时也可因为其增加骨骼肌血液流量等的作用而减少了其他因素(如缺氧、代谢废物堆积、能量物质供应不足等对骨骼肌的损害10,其总体效应是对骨骼肌有一定的保护作用。4 总结在耐力运动中NO能够促进骨骼肌内超氧化物自由基及其衍生物自由基的生成,较高浓度的NO 还能够促进过氧化氢、过氧化物和脂质氢等自由基的生成,对骨骼肌有一定的自由基损伤作用。但其上调血流量的保护作用能够部分抵消其带来的自由基损害作用。5 参考文献1Koppenol WH.The basic chemistry of nitrogen monoxide andper

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32、 of superoxide,peroxyni trite,and carbon diox ide.Free Radic Biol Med,1998,25(4-5:392-403.学报,2005,45(3:176-178.5B oyd CS,Cadenas E.Nitric ox ide and cell signaling pathwaysin mitochondrial-dependent apop tosis.Biol Chem,2002,383 (34:411-423.6Brune B,Zhou J,Von Knethen A.Nitric oxide,oxidativestress,and apoptosis.Kidney Int Suppl,2003,84:22-27.7Keynes RG,Garthwaite J.Nitric Oxide and its role in is-chaemic brain injury.Curr Mol Med,2004,4(2:179-191.8张漓,冯连世,宗丕芳.补