异质性万古霉素耐药葡萄球菌分离及生物学特性观察

1、异质性万古霉素耐药葡萄球菌分离及生物学特性观察    摘nbsp;nbsp;要nbsp;目的：了解本地区临床标本中异质性万古霉素耐药葡萄球菌（hVRS）分离率，并对其生物学特性进行观察。方法：采用琼脂筛选和菌谱分析法对56株甲氧西林耐药的葡萄球菌进行检测，同时对分离细菌的生长特性和超微结构进行观察，并与同源性敏     马筱玲  王敬华  李华  陈多炎  濮跃晨 摘  要 目的：了解本地区临床标本中异质性万古霉素耐药葡萄球菌（hVRS）分离率，并对其生物学特性进行

2、观察。方法：采用琼脂筛选和菌谱分析法对56株甲氧西林耐药的葡萄球菌进行检测，同时对分离细菌的生长特性和超微结构进行观察，并与同源性敏感菌株及金黄色葡萄球菌标准菌株相比较。结果：本地区hVRS检出率为14.3，其中血浆凝固酶阴性葡萄球菌的分离率（23.1）明显高于金黄色葡萄球菌（6.7）；耐药亚群与同源性敏感菌株和标准菌株比较，生长速度减慢，在固体培养基上菌落大小不等，在液体培养基中呈沉淀生长，电镜观察可见细胞壁增厚。结论hVRS在本地区的临床标本中有一定的分离率，应引起重视；该菌的很多生物学特性与同源性敏感菌株有所不同，其中细胞壁增厚是比较明显的改变，并与该菌的耐药性有关。 关键词：葡萄球菌；

3、万古霉素；异质性耐药；细胞壁    Heteroresistance Staphylococcus to vancomycin：detection and biological characteristic   马筱玲  王敬华  李华  陈多炎  濮跃晨 MA Xiaoling，WANG Jinghua，LI Hua，CHEN Duoyan，PU Yuechen. Department of Clinical laboratory，Anhui Provicial Hospital，Hefei 230001，China &#

4、160; Abstract Objective：To investigate the prevalence of heteroresistance Staphylococci to vancomycin（hVRS）in our are and observe its biological characteristics. Methods：56 strains of methicillin resistant Staphylococcus（MRS）were screened by vancomycin agar plates and confirmed by population analysi

5、s profiles. The growing states and ultrastructure of resistant subpopulation were observed and compared with their parent strains and standard strain of S. aureus. Result Of 56 clinica strains of MRS，8 strains were detected as hVRS，the detective rate was 14.3，The hetroresistance to vancomycin in coa

6、gulasenegative Staphylococci（hVRCNS） is more often than in S.aureus（hVRSA），the detective rate was 23.1 and 6.7，respectively. Comparing with their parent strains，hVRS showed slower growth and multiple colonial morphologies on solid medium，deposit groweh in liquid medium，and thicken cell wall with ult

7、rastructure.    Conclusion：There were many differences between hVRS and their parents，the thicked cell wall was the most remarkable characteristics，which is responsible for the vancomycin resistance of Staphylococci. The presence of hVRS in clinical isolates should not be overloo

8、ked. Key words：Staphylococcus；heteroresistance；vancomycin；cell wall      甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）是引起医院感染的重要病原菌之一1，2，糖肽类药物（万古霉素）是目前公认的治疗这类细菌严重感染的唯一有效药物。然而，有文献报道，万古霉素的应用并不能有效降低患者体内MRSA的带菌率，也没有明显地降低MRSA感染的死亡率3，4。但是，迄今为止，万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）感染仅在2002年有2例报道5，6，万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）感染也少

9、见报道7，这很难解释万古霉素治疗MRSA感染的高失败率现象。1997年，日本首次报道异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（hVRSA）感染导致治疗失败的病例8，引起了医学界的关注。此后，美国、意大利、法国、西班牙等国9，10，11，12也陆续报道检出hVRSA和异质性万古霉素耐药凝固酶阴性葡萄球菌（hVRCNS），并且在日本和香港等地有hVRS传播的报道8，13。我国在这方面的研究刚刚起步14，本文使用琼脂筛选和菌谱分析法对56株临床分离的葡萄球菌进行检测，以了解本地区hVRS的分离率，并对分离菌的生物学特性进行观察。 基金项目：安徽省“十五”攻关项目基金资助（01013039） 

10、60;  材料和方法 一、材料 1.菌株：我院检验科2002年9月2003年2月分离的部分甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS）56株，其中 金黄色葡萄球菌30株、溶血葡萄球菌14株、表皮葡萄球菌12株；标本分别来自痰液、尿液、血液、前列腺液等。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213，ATCC 25923，粪肠球菌ATCC51299，购于中国药品生物制品检定所。 2.盐酸万古霉素：由美国礼来公司生产，效期内使用，使用前用ATCC 29213进行质控。 3.培养基：MH琼脂和MH肉汤由杭州微生物试剂厂生产。 4.Etest试纸条：由瑞典AB biodisk公司生产   二

11、、方法 1.MRS菌株的鉴定和选择：使用VITEK32微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验，选择苯唑西林耐药的葡萄球菌。 2.培养基制配：称取18g MH琼脂和20g Nacl，溶解于450ml蒸馏水，调节pH为7.27.4，高压灭菌，冷却至4550，加入50ml预温至45的40g/ml盐酸万古霉素溶液，充分混匀，倾入平皿，琼脂厚度为4mm，即配制成4g/ml的万古霉素选择性培养基。同法，分别加入不同浓度的万古霉素即可配制8g/ml、16g/ml、32g/ml和64g/ml的万古霉素培养基。 3.筛选方法：将试验菌株用无菌生理盐水配制成0.5麦氏管（细菌浓度相当于108CFU/ml），稀释至10

12、6CFU/ml，取10l接种于4g/ml的万古霉素选择性培养基，35孵育48h，观察细菌生长情况，同时按美国CDC要求用ATCC25923作为敏感菌株，ATCC51299作为耐药菌株质控18。对筛选阳性菌株重新用VITEK32微生物分析仪进行细菌鉴定，以保证筛选菌株为葡萄球菌。 4.菌谱分析方法：取筛选阳性的菌株用无菌生理盐水分别配制成106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml、109CFU/ml、1010CFU/ml等不同浓度的菌悬液。取每个浓度菌悬液10l，同时分别划线接种于含万古霉素4、8、16、32和64g/ml的培养基，35孵育48h，进行菌落计数，计算耐药亚群出现频

13、率，质控方法同上。 5.MIC测定方法：采用微量肉汤稀释法，使用含4 Nacl的MH肉汤代替普通MH肉汤进行检测，孵育时间为48h。同时用Etest方法对MIC结果进行验证。 6.hVRS判断标准：根据Hiramatsu报道的方法，菌谱分析法符合以下条件者判断为hVRS，（1）细菌在8g/ml的万古霉素选择性培养基上生长，出现频率106（10万分之一）；（2）细菌亚群对万古霉素的耐药性相对稳定，在不含万古霉素的培养基中传代9代，耐药性不丢失14，15，16。 7.生长特性观察：将hVRS和同源性敏感菌株分别接种与含4Nacl和不含4Nacl的液体和固体培养基，35孵育24h和48h，分别观察细

14、菌生长状态，生长速度，菌落大小和菌落形态。 8.透射电镜观察：取hVRS、同源性敏感菌株以及标准菌株在血平板上生长24h的菌落，以Tris 缓冲液洗涤2次，低温离心机（4）4000r/min离心10min，2.5戊二醛固定，切片，透射电镜放大60，000倍观察并摄片。   结果 1.筛选试验结果：56株试验菌株有17株在4g/ml的万古霉素选择性培养基上可以生长，阳性率为30.4。    2.菌谱分析法确证结果：对17株被筛选出的菌株进行菌谱分析，根据hVRS判断标准，结果检出hVRS 8株（表1），分离率为14.3，其中30株金黄色葡萄球菌检

15、出hVRSA 2株（6.7），26株血浆凝固酶阴性葡萄球菌检出hVRCNS 6株（23.1），6株hVRCNS均由溶血性葡萄球菌产生。 3.MIC测定：使用微量肉汤稀释和Etest方法测得8株hVRS的MIC结果基本相同，相差在2个稀释度以内（见表1），图1为菌株10827的Etest结果。 4.生长特性观察：（1）hVRS生长速度较同源性敏感菌株和金黄色葡萄球菌标准菌株慢，24h生长菌落细小，48h方可出现肉眼可见的明显菌落；（2）在固体培养上hVRS菌落大小不等，表面干燥，无光泽；（3）在液体上hVRS呈沉淀生长；（4）4Nacl 有促进hVRS生长的作用。 5.电镜摄片结果：hVRS 的

16、细胞壁比同源性敏感菌株和标准菌株的细胞壁均明显增厚（见图2）。   讨论 1.hVRS的定义是指从临床标本分离所得的葡萄球菌原代纯培养物对万古霉素敏感（MIC4?gml），但在敏感的原代中，存在有部分对较高浓度万古霉素耐药的细菌亚群，这些耐药亚群可以通过一定方法从原代菌株中选择出来，对选择出的耐药亚群做MIC，浓度可以增加28倍。所以hVRS检测的是耐药亚群的MIC，而非原代菌的MIC，这是hVRS与VRS的主要区别15。因为hVRS是从万古霉素平板上反复筛选出的菌株，所以可能存在有体外诱导的因素，美国CDC规定：目前hVRS仅用于实验室研究，其结果不报告临床18。 2.hVRS出现

17、的频率低，在普通培养基上生长速度慢，所以采用常规纸片扩散法、肉汤稀释法和仪器法检测时，耐药亚群易被快速生长的原代敏感菌所掩盖，难以发现。目前最常用的方法是菌谱分析法17。该方法使用脑心浸液培养基为基质，将系列浓度的菌液同时接种到系列浓度的万古霉素选择培养基上，根据细菌生长情况分析结果。其缺点是工作量大，操作繁琐，培养基价格昂贵，且保存时间短，所以很难在临床实验室开展。我们在预试验中观察到hVRS在4NaCl环境中生长良好，所以使用含4NaCl的MH琼脂代替脑心浸液培养基进行试验。首先对临床分离的MRS菌株用含4g/ml的万古霉素培养基筛选，再对筛选阳性的菌株做菌谱分析，该方法简化了操作程序，降

18、低了试验成本，取得了良好的试验结果，从56株MRS菌株中分离出8株hVRS，hVRSA检出率为6.7，hVRCNS检出率为23.1，其分离率与日本学者及我国吴本权报道的结果相近4。表1所示，hVRS的MIC较原代菌株有数倍的增加，这与国外的报道是一致的15，20。 3.万古霉素治疗MRSA感染存在高失败率是各国普遍存在的现象19，21，我国的赵子文报道使用国产去钾万古霉素和进口万古霉素治疗MRSA感染患者14天，临床有效率分别为：80.9和78.7；患者体内细菌不能清除率分别有19.1和17.14。有关万古霉素体外药敏试验结果为敏感，而临床治疗失败，是否与hVRS存在有关，多数文献报道是肯定的19，21，但Schwaber认为这些报道选择的病例较少尚不能判断治疗失败是由hVRS引起，还是hVRS最终发展成为VIS的结果22。但无论hVRS的检出是否与万古霉素治疗失败有关，各国学者普遍认为临床实验室开展hVRS的筛选检测是非常必要的，因为该菌可能会发展为中介耐药（VIS），最终发展成同源性耐药（VRS）21。    4.hVRS的耐药