EVs检测方法整理

1、A、EVs外部特征（大小和表面蛋白）检测方法CurrentmethodsforEManalysisTEMrramniiiondecirtm嘀5彼10,，FM1sdynanikLigtiisvarreringtNTAnanoparricklackingmaty4%FCAffluw<yinmein;XFUautmicfbrvemkrusoipy,RPSreisriwpub*尔n3ing,ANncldflow讪riitnarMnTechniqueParticlesizeTimeformeasurementLimitationsAdvantagesCrybTEM<1nm.mm>1hS

2、amplepreparationtonlysmallanuiuntnfsampQisanaly/TMorphology口格homiMJynenm61rlm-2minchjllrnyiiig,prcsci'iceoflargeparcicksbiasesresultsWidesizerangeDLS,heterodyne0.5nm.6-2minAnaloghoniod)iicDLS,butnotasdominantWiderangesofsizeandconcentrationXIA20nm1pm510minDilutionnecessaryforhighconcentrationnon

3、-standjrdizednithodVisualizjtion,rcscJudcn(evenpolydispersesamples)TlowconcentratinnsFCM300-300nm10阿IininWorkingrangeTporeblocking,calibraticaFluorescence,informacianAFM10-100()nm>1hAnalogvry<>-TFMMnrphnl口gyRPS5。iim10nm,dept?tidenronporesize30minWirkingrange,porehLxki”，calibrAiioiiHigh"

4、;对luticrincornpaiiblcwixhbuflersAPcju5nnito20pmhSampledilmiun、interactionofsampleiithmembraneFractiunarion1、Dynamiclightscattering（DLS）:动态光散射技术原理：通过测量样品散射光强度起伏的变化来得到样品颗粒大小信息的一种技术。“动态”是因为样品中的分子不停地做布朗运动，正是这种运动使散射光产生多普勒频移。步骤：首先根据散射光的变化，机多普勒频移测得溶液中分子的扩散系数D,再由D=KT/6兀nr可求出分子的流体动力学半径r（K为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，n为溶液的

5、粘滞系数）关键参数：浓度（不能太浓，易发生二次散射，导致检测信号减弱）/光到样品以及散射光到检测器的距离。测量粒径范围：1nm-6um优点：样品制备简单，不需要特殊处理，可以反映样品分子真实状态；速度快，样品可回收；灵敏度高。缺点：分析粒径差不多的样品比较准确。对于样品颗粒大小差异大的，并不是很准确。如果样品中有比较多大颗粒样品，小颗粒样品的测量结果会受影响；不能检测荧光信息。aHomodyneonlyscatteredlightreachesdetectoretectorLaserMeasurementcellTidedwithsampleAutomste<lfocusby0IfSca

6、rteringjJSifipin<=5kL+QI/18、oplialVN内IM5VH巳teodyn巳ReferencerPANDscaneredlight，reachdetectorFig. 2 Principleofhomodyneand!heterodyneDLSsystems2、Nanoparticletrackinganalysis(NTA):纳米颗粒跟踪技术原理：与DSL类似。利用激光光源照射纳米颗粒悬浮液，利用全黑背景则功能强信号，可以清晰观察到带有散射光的颗粒的布朗运动。可以进行计数统计、浓度检测。具有荧光模式。测量粒径范围：10nm-2000nm(有文献报道能检测EV的最

7、小粒径为70nm)样品浓度范围：0.5E+6-1E+10/cm3,相比于DLS更低。推荐分析1000-10000个。缺点：1、荧光模式和散射模式是分开的。2、计术限制，检测的是二维平面信息，而Z轴方向是检测不到。LaserbesmSchematicsetupofananoparticletrackinganalyzer3、Flowcytometry:流式细胞仪粒径检测极限：300-500nm4、RamanMicrospectroscopy(RM):拉曼光谱原理：基于非弹性散射(改变方向和频率)。优点：可用于EVs亚型的鉴定缺点：价格昂贵，技术要求高；样品制备和采集时间长，10-100个/小时；

8、信号弱，非弹性散射信号强度小于弹性散射信号的1/10000;测量重复性差；EVs置于高剂量的光线下，会产生光反应，且是不可逆的。5、AtomicForceMicroscopy(AFM):原子力显微镜原理：利用微小探针与待测物之间交互作用力，来呈现待测物的表面的物理特性。将一个对力极为敏感的微悬臂的一端固定，另一端固定针尖。当针尖再样品表面扫描时，因针尖尖端原子与样品表面原子存在的范德华力，使微悬臂产生微小弯曲。检测悬臂弯曲所造成的微笑位移量，得到样品表面信息。缺点：EV的固定可能会影响其拓扑结构，结果会受到样品制备模式的影响；检测结果受微悬臂探头影响非常大，针尖的卷积效应可能会使横向结果的偏差

9、很大；成像范围太小，只要10科m*10科m；检测速度慢，测试一个样品通常要1小时以上。原理：当高电阻率的绝缘颗粒流经检测微孔时，会置换微孔中等体积的低电阻率电解质溶液，使得检测微孔电阻发生改变，并在检测微孔两端产生一个电流脉冲值或电压脉冲值。脉冲信号得个数反映流经检测微孔得颗粒数目，脉冲信号的幅值大小反映颗粒的尺寸大小。另外，当颗粒在电解质溶液中均匀分布且溶液流经检测微孔的速度一定时,可以用于浓度检测。测量粒径范围：100nm-100um,测量悬浮液颗粒绝对大小和浓度。缺点：样品形态，孔径大小和样品的导电性均会影响结果。不能检测生理盐水状态下的样品，因此限制生物样品的使用。中间孔径小于1umF

10、ig,5flestsLwRsesensing(UPS),LettTypicaJ的坪withtwocellsspsraledvaannsulaimgfrembHre叫ttiasinglegre.RightManaerttslgnd时currenticpiumtinga(itlar第|力vnal-,and(3>血1师班edptrbde.Fblowingmlitaratiori,countrMhth*nurnHrMpulwparfamvdntenM,rHIechthecofxj&niratiari/theportmsuspensiontobearal/7Dd可调电阻脉冲传感(TRPS)

11、:A、由于EVs的粒径异质性很大，较大的孔径可能会堵塞微孔。B、标准品的大小需要与样品尺寸一样，这对于未知样品检测不够灵活。7、FieldFlowFractionation(FFF):场流分离技术原理：用于大分子、胶体和微粒的分离。在相距很近的上下平板间构成扁平带状流道，载流液流于其中。载流为层流，其流型为抛物线型，中心线上速度最大。侧向场从侧面垂直与流动方向施加，侧向场导致不同成分处在距下壁不同位置上，从而有不同移动速度，在此前提下进行分离。通常矩形流道宽高比一般大于100:1。可分为电场场流分离、热场场流分离、沉降场流分离和流场场流分离。Larninarflowpump场rnri肃rfie

12、*pfafiteCrossflowpumpDetector8、Cryo-TEM:冷冻电镜冷冻电镜技术结合受体特异性金标记可用于EVs表型描述。冷冻电镜不需要对样品进行固定和脱水处理，因此EV的形态是真实状态下的9、ScanningElectronMicroscopy扫描电子显微镜：原理：用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的原子相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。样品需要固定和脱水，因此形状呈现一种扭曲的杯状。10、SingleEVAnalysis(SEA)Method光镜单个EV检测方法:11、ExoCounter:细胞外囊泡检测系统类似ELISA方法，用抗体捕获外泌

13、体.。但是CD9CD63CD81在外泌体的表达量均达不到100%,因此会损失很多信息。a5sdykit(disc)ExoCounterOpticaldhvE260nm260nmDiscgirooveNano-stnjctdreforexosomecaprunngExosomeassayq(iHwopticaldiscA|jL*/FGtwMS丽-CBAbConjuguiEjDiscw4hdelaLt-idbHJTdl炉*亡Ose(aralrClW*BJ>caatP(1)即sly(wjsoekMen!cwiiinwficiOMjriiprufm*Wash&DiyUp匚kI川M04MW

14、Vih#”i&MlbvcokintinihrpulsesWMII时S(T4uiwellInatKicjCauntM/XKJ电的5nmesper5cMndJ11.纳米流式检测仪（FlowNanoAnalyzer）原理：和传统流式有点类似，均是靠激光激发颗粒产生光信号。不同的是，纳米流式利用的是瑞利散射原理，主要检测200nm以下的颗粒。优点：散射检测范围71000nm（EV检测下限为40nm）,可以同时检测样品的粒径、浓度、表面蛋白信息以及内容物。缺点：荧光标记的样品需要超速离心去除游离染料。B、EVs内容物检测技术传统核酸的提取与检测RNA提取：酚氯仿抽提：提取时间长，步骤繁琐；纯度高

15、；商品化柱提法检测：PCR;RT-PCR;电泳；nextgenerationsequencing（NGS）。1.DropletPCR原理：在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待测核酸靶分子，或者含一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理以及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子起始拷贝数或浓度。技术优势：灵敏度高达0.001%;能克服核酸降解的不利影响；所需样本量少；可统计突变率；缺点：模板添加量要求较高（浓度过高导致全

16、部孔都有信号，浓度过低阳性信号孔过少，均不准确）；对引物特异性要求高。Ship10millontanpielsper50uLCCountdnople-tsOgita!nugwKvmHopWii期*0dkppWlEmchiCLilK'IOH1WTIIDH1R1J2Hi人二二工"2.MicrofluidicsforOn-ChipExtractionandDetection体）2.MicrofluidicsforOn-ChipExtractionandDetection体）（用于芯片内提取和检测的微流样品小于100ul;检测时间小于3小时。样品小于100ul;检测时间小于3小时。3

17、. Ion-ExchangeNanodetector（离子交换纳米检测器）原理：通过交错换能器在交流电流作用下压电晶体表面产生表面声波（saw）,实现了电动势的裂解。EVsXReleasedRNASAW*(J)transducer.Scatteredwave/#、*SPiezoelectricsubstrateC、EVs蛋白的检测技术细胞外囊泡的蛋白主要来源于细胞膜和细胞质，并不来自细胞器。特别关注跨膜蛋白和包浆蛋白。外泌体膜蛋白主要有四分子交联体大家族（CD9/CD63/CD81）,在膜转运和生物合成成熟起作用。但是这些蛋白并不只是在外泌体中存在。微囊泡膜蛋白主要有整合蛋白、选择蛋白和CD4

18、0配体。细胞外囊泡还包括特异的跨膜蛋白受体（皮生长受体（EGFRs）和黏附蛋白（上皮细胞黏附分子EpCAM）细胞外囊泡囊内蛋白：TSG101/ALIX/annexins/Rabs,在膜转运中起作用；骨架蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白）；分子伴侣HSPs；代朗WGAPDH。CoKiariMnofnewtechnologiesforEVproteindetectiai.FlitlwriinSp崎Detivtioi1jinitAdi'anla<ncLtaiisitionsRuJkh壁HPnwcjlpmctF'E、门ptuMpn垣文Handtlunrcciiith-label

19、ed-.Hirli|«rhpii嗔2|1vstabhhixlmclhixl.R$lM、Elyh电heg故iEtiwgntScnullpuniuk%噫SarkingundrtuurvsccjiceStngkLVinolcvularchaEctEm昌tizn*Kwquw耳EtidikdiuEtrumiLmlaiicmmullEVidentifkaliQEiFiciScrrenPhoMcn如bradl-WaNh-firc1lijjjhihnNjg'hpmriPcrcvtsMcsiclo<200nmM讪心IMRNMR、心1E%、1liun；Lti、chackgroundlIlf

20、vMljdipiiltiPLEX$PRHJEVsLibddcicaicnHighlyMTiMg中Rpqu触力wpcmHpl弟rnnniuchipHighthiwphpijtiMFXHlecEToctiemicttl-1。*f.vELasyinuse.Mediumthrou5ipiil1w"i''««r.WesternBlottingandELISAHSP70F*0tillin-1CD63TSG101Calnexin.质谱分析高通量肽谱分析，分析的关键是进行肽分离（SDS-PAGE/二维相色谱/等电聚焦分储）优点：高通量、定量和蛋白组学分析缺点：时间

21、长（天）.传统流式细胞术+微球富集法缺点：不能进行单一EV检测；得到的结果是平均值。优点：可进行高通量检测.小颗粒流式细胞术（100nm）FlowCellLaseir一Beam(4SSnmPMr-nilerOpticalFiberCoNsctign5thSurfaceareanm2)口吐的14885,微型核磁共振原理：由于大多数生物实体缺乏铁磁T背景，当它们被纳米磁珠（MNPs）靶向时，此时它们与原生的生物实体形成强烈对比。在基于核磁共振（NMR）的磁检测中，将MNPs置于NMR磁场中，会产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫速率，从而放大分析信号。检测灵敏度是westernblot和ELIS

22、A的103倍。CirQ.imtingEVsFillratioflFuHrfUion6. Nano-plasmonicExosome（nPLEX）Sensor（纳米等离子体外泌体传感器）原理：基于表面等离子体共振：1、根据法国物理学家菲涅尔所提出的光学定理：ziisinBi二HzsinOz可知，当光从光密介质射入光疏介质,入射角增大到某一角度，使折射角达到90。时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。（图当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被

23、称为消逝波；2、等离子体通常指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子波。3、我们在前面提到光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进