212165 寡核苷酸类抗流感药物钠含量测定 仲婕

1、寡核苷酸抗流感药物钠含量测定仲婕1,2，李保山1,2，朱德领1,2*，张金钟1,2，施明珠1,2（1. 杭州天龙药业有限公司，浙江杭州 310021； 2.军科天龙药物研究院，浙江杭州 310021）摘要：目的：用离子色谱法、原子吸收光谱法评价抗流感药物钠含量，以了解两种方法的在生产检验中的优劣。探讨两种测量方法定量结果的一致性。方法：在戴安ICS900离子色谱仪上，用阳离子分析柱Ionpac CS12（4×250mm），流动相：甲烷磺酸；电导检测；流速1mL·min-1；测量结果与国标方法（火焰原子收光谱法）进行方法学评价比较；应用配对t检验和Bland -Altman法

2、对两种测量方法进行一致性评价。结果：两种方法的精密度分别为：2.0%和0.7%，重现性分别为2.0%和7.96%，回收率分别为97.2%和89.5%，线性方程分别为：Y=105.22X=0.1007,r=1.0000,Y=0.2894X+0.006, r=0.9991；测量结果无显著性差异，配对t检验P0.05；Bland -Altman一致性评价的95%一致性界限为：(-1.514,1.487)，绝大多数差值都位于该区间内。结论：离子色谱法的重现性和回收率均优于原子吸收法；Bland -Altman法综合判断两组数据具有高度的一致性。关键词：离子色谱法;原子吸收光谱法;钠含量；t检验；Bla

3、nd -Altman法;一致性Study on the content of sodium in oligonucleotide bulk pharmaceuticalsZHONG Jie1,2，LI Bao-shan1,2 ZHU De-ling1,2* ZHANG Jing-zhong1,2，SHI Min-zhu1,2 (1.Hangzhoutianlong Pharmaceutinal CO.,Ltd.，Hangzhou 310021, China;2. Institute of Junketianlong Materia Medica, Hangzhou 310021, China

4、)ABSTRACT: OBJECTIVE Determination of sodium content in oligonucleotide bulk pharmaceuticals by ion-chromatography and atomic absorption spectrophotometry. To evaluate the the degree of agreement between measurements.METHODS The precision,linearity, repeatability and analytical recovery were evaluat

5、ed on Dionex ICS900 and Shimadzu AA-6300C. By using paired t test and Bland-Sltman method to estimate consistency of two kinds of instrument and decide whether the data is replaceability or not. RESULTS The two method results showed that the precision were 2.0% and 0.7%,the repeatability were 2.0% a

6、nd 7.96%,the analytical recovery were 97.2%(RSD=2.46%,n=6) and 89.5%(RSD=8.59%,n=6) for ion-chromatography and atomic absorption spectrophotometry,respectively. The mean difference was -0.0136% with 95% confidence interval -1.514 to 1.487.Most of the differences lay between these limist (between d-1

7、.96s and d+1.96S).CONCLUSION There is no significant difference compared with the standard methodflame absorption spectrum method. Moreover, the ion-chromatography method had demonstrated its superiority in repeatability and analytical recovery.KEY WORDS: IC;AAS;comparison;paired t test; bland-altma

8、n method; the degree of agreement基金项目：“十二五”国家重大新药创制科技重大专项：核酸药物“流感泰得”鼻喷剂的临床前研究(基金编号：2011ZX09102-009-09)作者简介：仲婕 女 副研究员 Tel： E-mail：*通讯作者：朱德领 男，教授级高工 Tel： E-mail： 钠离子的电化学分类是很复杂的，抗流感新药FLUTIDE，是寡核苷酸的钠盐，分子式为C126H152O70N36S12P12Na12，因为分子量较大，受大分子环境的影响，钠电离更为复杂，因此分析方法上有些局限。测定钾、钠的方法较多，有化学比浊法，已宣布淘汰，火焰光度法（EP），EP

9、的分析条件难以控制，且灵敏度及精密度都比原子吸收法和原子发射法差，离子选择电极法（ISE），但电极老化快，寿命短，造成消耗品成本大，电极的材料不同，电极的选择系数也不同，这对待测离子的影响是一个难以预测的变量。原子吸收光谱法（AAS）是国家标准1和医院制剂2检验中常用的方法。我们应用现已有的仪器条件，用AAS法和离子色谱法同时测定寡核苷酸抗流感药物中钠含量，前者是将样品的水溶液吸进空气-乙炔火焰中，钠被解离成基态原子，能吸收588.9或330.2特征谱线的光（特征谱线由钠空心阴极灯提供），与标准钠溶液比较光谱吸收量，记录峰高。后者是用应用了离子交换的原理，使被测钠离子在阳离子交换柱上与H+交换

10、，再用强阳离子洗脱剂洗脱下来，以达到与基质中相邻峰的分离，将产生的电导信号，转变成色谱值，与标准钠离子比较色谱值确定含量。从光谱数据和色谱数据综合分析这一大分子中的钠含量，比较两种方法的优劣，评价两种方法所得结果的一致性成度3-4。1 仪器与试药离子色谱仪（ICS-900，美国Dionex ），抑制型电导检测器，Chromeleon色谱工作站。色谱柱为Ionpac CS12离子交换柱（4 mm×250mm）。原子吸收分光光度计（AA-6300C，日本岛津），钠空心阴极灯（日本HAMAMATSU PHOTONICS K.K.公司），乙炔气（纯度98%,杭州气体厂），空气压缩机（QSAC

11、-106,北京瑞昌汇博科技有限公司）。钠离子标准溶液(1000mg·L-1，国家标准物质研究中心)，甲烷磺酸（优级纯，批号：，Fluka 分司）超纯水（18.2M·cm-1，Millipore公司）试验用药物（寡核苷酸抗流感新药，军事医学科学院放射与辐射医学研究所九室）。2 测试条件2.1 离子色谱法（IC）色谱条件：淋洗液为20mM甲烷磺酸，电导检测；流速1mL·min-1；抑制器的抑制电流为59mA；进样量10L。2.2 原子吸收分光光度法（AAS）吸收波长588.9nm，狭缝0.2nm，灯电流8mA，燃烧器高度6，角度0°，乙炔-空气火焰，燃气（乙

12、炔）1.8L·min-1，助燃气（空气）15.0L·min-1，进样体积20L。3实验方法3.1 对照品溶液的制备和线性 取市售钠标准溶液(1000mg·L-1 )，用超纯水稀释至下表所列浓度，作为对照品溶液，分别用原子吸收法和离子色谱法测定吸收度（AAS法）和峰面积（IC法）。结果见表1。表1 两种方法对比试验结果(n=3)Tab.1 Comparative study of IC and AAS to determination the sodium content AAS法IC法浓度/ppm吸收值浓度/mg·mL-1峰面积10.06250.0309

13、0.0001250.057920.12500.04890.01251.290030.25000.07950.12513.307340.50000.14000.50052.975051.00000.28351.000105.180362.00000.5927线性方程Y=0.2894X +0.006, r=0.9991Y=105.22 X + 0.1007, r=1.0000线性范围0.06252.0000 ppm0.0001251.000 mg·mL-1精密度RSD 0.70%，n=6RSD 2.00%，n=6重现性RSD 7.96%，n=6RSD 2.00%，n=6回收率89.5%，

14、 RSD8.59%，n=697.2%， RSD 2.46%，n=63.2 样品前处理 取样品0.40.5g置钳锅中，电炉上缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加浓硫酸1ml使润湿，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在500600（实验中控制马福炉温度在550）使完全灰化，移至干燥器中，备用，临用时以水定量稀释至所需浓度，作为供试品溶液。3.3 精密度试验取钠标准溶液，IC(0.029mg·mL-1）, AAS(0.83ppm)，分别用离子色谱法和原子吸收法重复测定6次，RSD分别为2.00%和0.70%。结果见表1。3.4 重现性试验取同一批样品，6份，按3.2项下样品处理方法制得样品贮备液，按IC和

15、AAS所要求的浓度范围稀释，进样，测定样品含量，计算RSD分别为IC法2.00%和AAS法7.96%。结果见表1。3.5 回收率测定3.5.1 IC法回收率试验取样品0.23g，共6份，分别至25ml容量瓶中，加水溶解，分别取4ml置钳锅中，加入钠标准溶液(C=1 mg·mL-1)2.5ml，置电炉上缓慢蒸干，置于500600的马富炉中，炽灼至灰化，残渣用水溶解，定量转移至10ml容量瓶中，加水至刻度，作为母液。取1ml母液置10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，作为IC法回收率测定用溶液，分别进样10l，按供试品溶液的方法测定。结果见表1。3.5.2 AAS法回收率试验取3.5

16、.1项下的母液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，再取1ml置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，作为AAS法的加样回收率测定用溶液。分别吸入样品,测定吸收值，计算回收率。结果见表1。3.6 样品的含量测定取样品0.46g，每批样品取2份，置于500600的马富炉中，炽灼至灰化，残渣用水溶解，定量转移至容量瓶中，加水稀释至所需浓度，样品测定结果见表2。3.6.1 t检验假设H0:两种仪器方法检验结果含量无偏差,即d=0；H1:有偏差, 即d0，=0.05因为n=12, d=-0.164 d2=6.448，所以偏差的平均值为-0.164/12=-0.0136(%)Sd=1.94t=0.0

17、24= n-1=12-1=11.查t界值勤表,t0.05,11=2.201,现t=0.024<2.201,得P>0.05,按=0.05水准接受H0假设。3.6.2 Bland-Altman 检验用差值进行Bland-Altman的分析3-4，见图2。从图中可以看出，差值的均数为-0.,差值的标准差Sd=0.765，则95%一致性界限为(-1.514,1.487)。全部点在95%一致性界限以内，差值的绝对值最大为1.286%,两种方法平均为6.33%,这种相差的幅度在实际产品检验中可勉强接受。因此可以认为两种方法测量的结果仍具有一致性，可以相互替代。用比值进行Bland-Altman

18、的分析5，见图3。从图中可以看出，比值的均数为1.000847,接近于1.000,比值的标准差Sr=0.12，则95%一致性界限为(0.764,1.238)，所有点在此95%一致性界限以内,且最大值为1.209，最小值为0.784。图1 离子色谱图A-对照品溶液；B-供试品溶液； Fig.1 IC chromatograms A-standard solution; B-sample solution图2 用差值进行Bland-Altman分析图Fig.2 Assessing agreement between two measurements with differences by Blan

19、d-Altman method图3 用比值进行Bland-Altman分析图Fig.3 Assessing agreement between two measurements with ratios by Bland-Altman method4讨论4.1 离子色谱法测样品中的钠离子，目标峰与其它峰可实现较好地分离，分离度为1.92：理论塔板数以钠离子峰计算为2869。见图1。4.2 样品在450550加热灰化45h，以破坏样品的有机物基体，排除大分子有机物干扰，同时克服本品大分子水溶液粘度对喷雾速率的影响。4.3 为了排除基质干扰，在原子吸收测定方法中还标准加入法测定，通过用两种方法对同一

20、批样品(第7批样品)钠含量进行平行测定，标准曲线法为6.90%，标准加入法为7.01%，结果具有可比性，基本一致，说明标准曲线法和标准加入法均可精确测得本品的钠含量。4.4 配对t检验说明，假设H0成立，两种仪器方法检验结果含量无偏差,即d=0。Bland-Altman分析法综合考虑了两种仪器的系统误差和偶然误差，综合判断的结果显示：两组数据具有高度的一致性，以一致性界限和实际生产意义，得出这两种方法测钠的方法具有可替代性的结论。4.5 离子色谱法的重现性和回收率均优于原子吸收法，在条件允许的情况，首选离子色谱法测定钠含量。REFERENCES1 GB/T 13888-2003(国家标准)&#

21、160;S. 20032 ZHOU B H，ZHANG F，WANG J，WANG Z CH，CAI H SH. Study on the content of sodium in Compound sodium lactate injection by AAS. J. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 1995, 12(6): 21-23. 3 Altman D G, Bland J M. Measurement in medicine:the analysis of method comparison studies. The Statistician,1983,32:307-317.4 Bland J M,Altman D G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement.Lancet,1986,1:307-310.5 CHEN H. Applications of Bland-Altman method for