蛋白质等电点测定

1、蛋白质等电点测定及性质试验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉力量的关系。初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面四周的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz

2、提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了集中双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。依据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则集中地分布在溶液中，构成双电层的集中层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在集中层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成集中层。滑动

3、面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为电势。固体颗粒带电量的大小及测量方式？电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，集中层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都

4、带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互分散，成为比较稳定的胶体溶液。假如消退水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消退时，蛋白质分子就会相互分散成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分别蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电：蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH

5、的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分别、提纯和电泳。蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。蛋白质在等电点时溶解度最小，最简洁沉淀析出。蛋白质等电点的测定各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.74.8，血红蛋白等电点为6.76.8，胰岛素是5.35.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电

6、点在pH 12.012.4。本试验接受蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很精确，但在一般试验条件下都能进行，操作也简便。蛋白质的等电点比较精确的方法是接受等电聚焦技术加以精确测定，但需肯定的试验条件。等电聚焦电泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有

7、pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值渐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过肯定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分别的蛋白质区带。沉淀反应：蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。

8、主要的沉淀现象有（1）盐析：在蛋白质水溶液中加入足量的盐类（如硫酸铵），可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分别与初级提纯。（2）变性：在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下，引起蛋白质某些理性质转变和生物学功能丢失。这是一个不行逆过程。（3）加入肯定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时间内是可逆反应；（4）加入生物碱试剂（含氮的碱性物质）：能使生物碱沉淀或作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。当溶液的pH小于PI时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白质的主要

9、成分，常温下在水中可溶解0.81.2%，微溶于25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸取水分。当浸入水中则快速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。构造极为简单，没有确定的分子式。分子量约为57000375000，在牛奶中约含3%，占牛奶蛋白质的80%。三、器材及试剂：1器材：试管1.5厘米（9）。吸管1毫升（2），2毫升（2），10毫升（2）。容量瓶50毫升（2），500毫升（1）。试管架。2试剂：0.01molL-1醋酸溶液。0.1molL-1醋酸溶液。1 molL-1醋酸溶液。1 molL-1氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。酪蛋白。四、操作步骤：1制备蛋

10、白质胶液（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入40的蒸馏水。（2）加入50毫升1 molL-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。（3）在容量瓶中再加入1 molL-1醋酸溶液50毫升，摇匀。（4）加入蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1 molL-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。2等电点测定按下表挨次在各管中加入蛋白质胶液，并精确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后马上摇匀。管号蛋白质胶液(毫升)H2O(毫升)0.01molL-1HAC(毫升)0.1molL-1HAC（毫升）1molL

11、-1HAC（毫升）pH观 察0分钟10分钟20分钟1234567891111111118.387.758.758.508.007.005.001.007.400.621.250.250.501.002.004.008.001.605.95.65.35.04.74.44.13.83.5观看各管产生的混浊并依据混浊度来推断酪蛋白的等电点。观看时可用+，+，+，表示浑浊度。3. 蛋白质性质试验（1）蛋白质的盐析在试管里加入12毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸铵饱和溶液，观看现象，有无白色浑浊产生。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。（2）蛋白质的变性在试管里加入2毫升蛋

12、白质的水溶液，沸水浴加热5分钟，观看现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观看现象。在试管里加入3毫升蛋白质的水溶液，加入1毫升硫酸铜溶液，观看现象。（有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生）。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观看沉淀是否溶解。五、思 考 题1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的试验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、分散而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本试验中，酪蛋白质

13、在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必定沉淀出来。这种结论对吗？为什么？不肯定会沉淀，由于蛋白质表面有亲水基团，只是在等电点的时候颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。3、在分别蛋白质时等电点有何实际应用意义？不同的蛋白质有不同的等电点，在分别蛋白质的时候只要调整混合蛋白质溶液的pH值，就可以在不同的pH下得到不同的蛋白质。清代“红顶商人”胡雪岩说：“做生意顶要紧的是眼光，看得到一省，就能做一省的生意；看得到天下，就能做天下的生意；看得到外国，就能做外国的生意。”可见，一个人的心胸和眼光，打算了他志向的短浅或高远；一个人的期望和幻想，打算了他的人生暗淡或辉煌。人生能有几回搏，有生不搏待何时！全部的机遇和成功，都在布满阳光，布满期望的大道之上！我们走过了黑夜，就迎来了黎明；走过了荆棘，就迎来了花丛；走过了坎坷，就走出了泥泞；走过了失败，就走向了成功！一个人只要心存期望，坚强坚韧，坚持不懈，勇往直前地去追寻