人偏肺病毒疫苗研究最新进展.docx

1、文献速览人偏肺病毒疫苗研究最新进展人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,hMPV)和它相近的同病毒科成员呼吸道合胞病毒一样，是儿童下呼吸道感染的主要病因。hMPV也是世界范围内引起免疫功能低下者和老年人发病及死亡的常见原因。感染的反复发生也加重了医疗负担。然而，目前并没有针对hMPV的特异性预防措施。本文着重概述目前关于阐述hMPV疫苗的研究进展的文献。我们认为对宿主应答中病毒蛋白的作用更好的认识有利于有效预防性疫苗的研发。1人偏肺病毒hMPV是一种负义单链RNA病毒，属于副黏病毒科，该科还包括了呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)和副流

2、感病毒°hMPV在2001年被发现不久,就很快被认为是幼儿、免疫功能低下者和老年人下呼吸道感染的常见病因。虽然hMPV是重要的临床病原体，但目前却没有疫苗。hMPV包含两个基因群体：A和每个基因群体乂有两个基因亚群，分别是A1和A2.B1和B2。目前,hMPV共有5个当代流行病毒株，它们已经存在了数十年°hMPV的反基因组包括表达病毒蛋白的九个开放阅读框：3'NPMFM2-1-M2-2-SH-G-L-5，。其中核蛋白N,磷蛋白P和大蛋白L是RNA合成所必需的。RNA合成由两个独立的过程组成:病毒复制和基因转录。首先由蛋白L和蛋白P组成的RNA依赖性病毒RNA聚合酶(

3、RdRp)结合在N.壳体化基因组的前导区，然后通过识别起始和终止信号沿病毒基因的一侧依次转录每段基因。在合成阶段mRNA被帽化和聚腺苜酸化。当有足够的核蛋白来壳化反基因组和基因组时，复制开始。首先负链基因复制成正链反基因，然后正链反基因作为模板复制成病毒基因的多个拷贝。除了蛋白P和L,M2.2蛋白对病毒RNA合成也是重要的。与RSV的M2.2蛋白一样，从病毒基因的转录到病毒基因的复制过程中，hMPV的M2-2蛋白是否是病毒RNA聚合酶开关的关键调节因子仍存在争议。磷蛋白P、糖蛋白G、疏水蛋白SH和M2.2蛋白都显示出调节宿主免疫应答的作用。分别缺乏或组合缺乏G、SH和M.2的重组hMPVs以及

4、用禽类病毒蛋白P替换人类病毒蛋白P的重组hMPVs都是减毒的。融合蛋白F对hMPV的入侵是必要的，并且还能诱导强的体液免疫反应。在本文概述中，讨论了基于上述蛋白功能的hMPV疫苗研发的现状和进展。2灭活疫苗福尔马林灭活流感疫苗因其优良的稳定性，易于规模生产，无病毒复制方面的生物安全性等原因，通常被用来进行大规模免疫接种。然而，福尔马林灭活的人RSV疫苗(Formalin-inactivatedhumanRSVvaccine,FI-hRSV)接种会导致自然感染后疾病加重。疾病加重可能因为：(1)Th2型的T细胞记忆应答；(2)甲醛过敏;和/或(3)产生未成熟抗体及其对自然感染hRSV表位的轻微识

5、别。最近有报道说RSV糖蛋白G肽链接种后FI-hRSV接种引起的疾病加重减少了，这说明抗RSVG蛋白的特异性抗体对RSV传染病控制是至关重要的。同样，在实捡动物接种福尔马林灭活hMPV后也出现与疫苗相关联的肺部疾病加重和hMPV感染后的Th2应答。这说明福尔马林灭活hMPV不是一个合适的候选疫苗。研究用其他的灭活方式来研发安全疫苗。例如，用纳米乳剂辅佐的灭活RSV也显示出可以诱导产生持久的RSV特异性体液免疫应答，可以降低黏液的产生，增加病毒的去除,同时没有伴随Th2免疫介导的病理作用。同时，疫苗接种小鼠呈现出加强的Thl/Thl7应答。虽然纳米乳剂辅佐的灭活RSV候选疫苗仍需要进一步研究，但

6、是如果纳米乳剂灭活hMPV具有免疫原性和保护性且有平衡的免疫应答,那么纳米乳剂就可以应用到hMPV。3病毒蛋白疫苗亚单位疫苗是一种经过纯化的、通过全基因序列或部分基因序列表达而成的病毒蛋白。这种疫苗经常以VLP、纳米颗粒或辅以免疫增强佐剂的形式存在。在副黏科病毒中具有最优的免疫原性的蛋白是融合蛋白F。例如，种与hMPV相近的同家族成员RSV,由Novavax以其F蛋白研发的纳米颗粒疫苗正在进行U期临床的评估c近年来，一些利用hMPV蛋白研发的亚单位候选疫带正在进行动物试验。以逆转录病毒的核心颗粒作为载体，腹腔注射hMPVF蛋白能够引起抗同源和异源病毒株强烈的体液免疫应答。此外，诱导的中和抗体能

7、降低随后因肺部感染同源和异源病毒株而导致的死亡率,而接种hMPV糖蛋白G后却不能引起中和活性。在以w病毒复制子和3型副流感病毒(Parainfluenzavirustype3,PIV3)为载体的hMPVF蛋白疫苗也存在类似的结果。研究表明,动物肌肉注射含有佐剂的可溶性hMPVF蛋白能够引起体液免疫应答，但这种应答会随着时间很快消失。最近，Williams团队研究表明，用悬浮培养的人胚肾上皮细胞(293-F)表达基质蛋白(M)和F蛋白形成hMPVVLPs,它提供的免疫保护能够抑制hMPV在小鼠肺部的复制，而这种保护与Th2失衡的细胞因子无关。小鼠免疫接种F-M-VLPs能够增强F蛋白特异性抗体应

8、答和增加识别F蛋白表位的CD8+T细胞。通过添加TiterMaxGold佐剂或a-半乳糖神经酰胺佐剂来加强VLP诱导的中和抗体应答。以上结果表明，融合蛋白疫苗是hMPV疫苗研发的一个潜在候选者。其他用于蛋白疫苗研发的hMPV蛋白还有P蛋白和G蛋白。重组杆菌Calmette.Guerin(一种能够促进抗其他细菌、寄生虫和病原体抗原免疫应答的载体)表达的hMPVP蛋白赋予了CD4'和CD8*T细胞强大的表型效应，其表现出的hMPV保护性免疫力与动物的主动免疫相当。然而，也有团队研究表明hMPVG亚单位蛋白不能够诱导保护性抗体应答，说明hMPVG蛋白对病毒的免疫原性不重要。对缺乏G蛋白的重组

9、hMPV(rhMPV-AG)的研究发现G蛋白在诱导保护性免疫应答方面起重要作用。尽管G蛋白在免疫原性上扮演的角色仍存在争议,但是在单蛋白免疫过程中，导致G蛋白出现不良的免疫原性有几种可能性:一种可能性是像之前研究的RSVF蛋白一样,在单蛋白免疫过程中，hMPVG蛋白在基因和/或蛋白质水平上经过了某些修饰;另一种可能性是与F蛋白相比，相同的载体携带G蛋白的能力降低。总之,G蛋白是否具有良好的免疫原性仍需继续研究阐明。用以hMPVF蛋白为基础的亚单位疫苗进行免疫接种是有前途的，但是疫苗的接种途径和载体类型的组合形式以及为了诱导更加持久和有效的免疫效力所需要F蛋白的长度仍需更多的实验来确定。由于hM

10、PV其他蛋白在免疫原性和免疫平衡方面仍有重要作用，因此，需要更多研究来阐明亚单位疫苗免疫接种对Thl/Th2/Thl7平衡的影响。4减毒活疫苗减毒活疫苗可以分为两类:非重组和重组疫苗。非重组减毒病毒通常通过自然突变以及病毒在细胞上传代过程中由于添加或去除实验压力导致的缺失来产生，实验压力包括比如化学突变剂和低温传代等。非重组减毒活疫苗主要的风险是病毒毒力逆转和病毒致病性恢复进而引起疾病。一些非重组RSV减毒活疫苗在进行临床试验评价，但显示出一些副反应和减毒不充分的情况。最近研制出温度敏感型hMPV病毒株，免疫仓鼠后显示出保护性免疫应答。重组减毒活病毒通过细胞转染hMPVcDNA基因组获得,进行

11、或不进行基因修饰或基因剔除，用质粒编码组成RdPp复合体的每一个必须蛋白。重组减毒hMPV病毒株已经通过剔除特定附属基因的方法获得。分别是rhMPV-AG,缺乏G和SH的重组hMPV(rhMPV-AG/SII),缺乏M2-2的重组hMPV(rhMPV-AM2-2)o在感染的仓鼠中，相比rhMPV野毒株感染,rhMPV-AG和rhMPV-AG/SH在下呼吸道和上呼吸道分别抑制了至少40倍和600倍的病毒复制。然而在啮齿类动物模型中，相比rhMPV野毒株，缺乏SH的重组hMPV(rhMPVASH)有时能更有效地感染仓鼠肺部，这说明SH对于病毒体内感染完全没必要，它的剔除没有减毒效果。在感染的非洲绿

12、猴中，突变的rhMPV-AM2-2相比rhMPV-AG达到了一个更高的水平，并且诱导了可比拟的免疫原性和保护效力。还有另一种减毒重组hMPV,它的P蛋白被禽类MPV的P蛋白(rhMPV-Pavian)取代。最近，在人感染实验中发现一个重组的hMPV野毒株适合做hMPV减毒活疫苗候选株的母本病毒。虽然rhMPV-Pavian对健康成人的感染力比较弱，但是rhMPV-Pavian这种弱感染力的机制以及是否其他重组减毒病毒对人有相似感染的问题需要将来进一步的研究。5未来设计疫苗需要考虑的其他因素虽然F蛋白被认为是决定hMPV免疫原性的一个主要因素，但是识别能激活保护性细胞毒性T淋巴细胞(Cytoto

13、nicT-lymphocytes,CTL)和体液免疫的病毒抗原对制定成功的疫苗接种策略来说还是必要的。已经证明几个CTL的肽段在对hMPV感染后的CD8+CTL应答中起作用。这些肽段是H-2b小鼠的N蛋白VGALIFTKL172,H-2d小鼠的M2-2蛋白CYLEINIEII64,HLA-A*0201转基因小鼠的SH蛋白KLILALLTFL44和G蛋白32SLILIGTTTL4io小鼠免疫接种hMPVCTL表位肽后，上调了hMPV攻击小鼠的肺部和支气管淋巴结的Thl型细胞因子的表达，进而降低了小鼠模型的病毒滴度和疾病的发生。最近,hMPVH-2d的显性和次显性表位被发现和鉴别出来。在12个选择

14、的预测表位中，M2.l蛋白白勺幻GYIDDNQSI'9和村蛋白白勺3°7spkaGLLSI?”认为是首次感染时H-2h的显性和次显性表位。另外，还发现了第二次、第三次感染后记忆性CTL应答中H-2d限制性表位的多样性，包括对抗M2-2蛋白的"CYLENIEII64的记忆性CTL应答的次显性作用。通过减毒活病毒rhMPV全基因删除而导致的表位缺陷会降低rhMPV诱导免疫原性的能力，这说明CTL表位免疫原性的重要性。为了延长以F蛋白为基础的疫苗接种的免疫原性或加强删除突变rhMPV的免疫原性,对宿主同时接种包含CTL表位的肽段可能是一个好的选择。由于N蛋白和M2-2蛋白

15、的抗原表位完全保守，所以CTL表位疫苗提供的保护有望覆盖两种hMPV病毒株°对抗病毒信号调节中的关键病毒蛋白的识别对疫苗设计来说也是至关重要的。最近,识别了一些病毒蛋白,比如G和M2.2蛋白，它们在抑制宿主的自然免疫力方面起重要角色。我们和其他研究者都发现M2.2蛋白是一个具有多种功能的蛋白。它不仅调节病毒基因转录和病毒RNA复制,而且还包含一个CTL表位以及维甲酸诱导基因I和Toll样受体的靶向中心配体。此外,M2.2蛋白也在调节miRNAs表达方面起重要角色，其中某些miR-NAs对免疫相关基因的表达起重要作用。对于多功能病毒蛋白来说,就更需要识别它们的功能区，因为这对合理设计重

16、组减毒活病毒来说很重要。最近,我们也识别了M2-2蛋白中负责抑制抗病毒信号的基序。所有这些关于M22的信息或许可以给以M2.2为基础的候选减毒活疫苗的设计提供一个基础信息。例如，包含以下突变的突变体：（l）M2.2，s病毒复制区域，可用作复制突变；（2）为了加强免疫原性，用蛋白的交互序列终止M22s对抗病毒信号的抑制。另一方面，为了尽可能减少病毒其他蛋白突变的概率，防止打破Thl/Th2平衡以及保持CTL表位的原始免疫原性，对病毒基因转录起重要作用的区域不应该被修改。总之，解析病毒蛋白的功能区域对疫苗研发是大有益处的。6讨论一个有效的理想候选疫苗应该是安全的，能比自然hMPV感染诱导出更强的免疫力和保护力，而自然hMPV感染只能引起不完全的免疫保护。研究发现FI-hMPV免疫接种棉鼠会加重动物感染hMPV后其肺部的病理变化，除此以外,FI-hMPV仍是一个有希望的候选疫苗。亚单位疫苗看似仅能对初次感染诱导出短期保护性应答。然而，亚单位疫苗却可能利于增强曾暴露于hMPV个体的免疫应答。此外,亚单位疫苗有希望给早产儿、免疫功能低下者和老年人等高风险群体提供一个持续一定时间的安全有效的保护,特别是以非感染载体的形式接种。目前