第七章固定化酶-酶应用过程

1、第七章固定化酶第七章固定化酶- -酶应用过酶应用过程程酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足 酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pHpH条件以外，大多数条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束样酶在反应系统中，与底物和产

2、物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 固定化技术固定化技术什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术v在一定空间

3、内呈闭锁状态的酶，能连续地进在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 固定化酶的优点：固定化酶的优点： 酶与产物、底物易分开；酶与产物、底物易分开； 可多批次使用和装柱连续反应；可多批次使用和装柱连续反应； 提高酶的稳定性；提高酶的稳定性； 产物中无酶残留，简化产品纯化工艺；产物中无酶残留，简化产品纯化工艺； 提高酶的使用效率，成本降低；提高酶的使用效率，成本降低； 增加产物收率，提高产物质量。增加产物收率，提高产物质量。 缺点：缺点： 酶活力损失；酶活力损失； 增加了酶的成本；增加了酶的成本； 只适用于可溶性底物，尤其可溶

4、性小分子只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，对大分子不适宜；底物，对大分子不适宜； 不适宜于多酶反应。不适宜于多酶反应。选择载体选择载体 应考虑：应考虑： 载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗粒状等；粒状等； 载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型；载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型； 载体的性质：水溶性和水不溶性；载体的性质：水溶性和水不溶性； 酶偶联量或装载量和实效系数。酶偶联量或装载量和实效系数。 无机（无机（inorganicinorganic） 天然有机（天然有机（organic from natural organic from natural

5、 sources)sources) 合成有机（合成有机（organic synthetic organic synthetic materials)materials)酶固定化时遵循的原则：酶固定化时遵循的原则： 维持酶的催化活性和专一性；维持酶的催化活性和专一性； 固定化应有利于自动化、连续化反应；固定化应有利于自动化、连续化反应； 固定化酶应具有最小的空间位阻；固定化酶应具有最小的空间位阻； 酶与载体必须牢固结合；酶与载体必须牢固结合； 固定化酶应具有最大的稳定性；固定化酶应具有最大的稳定性； 固定化酶易与产物分离；固定化酶易与产物分离； 固定化酶成本要低；固定化酶成本要低； 充分考虑固定

6、化酶在制备工程和应用中的安全充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。因素。酶的固定化方法酶的固定化方法 1 1 非化学结合法：非化学结合法： 结晶法、分散法、物结晶法、分散法、物理吸附法、离子结合法；理吸附法、离子结合法； 2 2 化学结合法：交联法、共价结合法；化学结合法：交联法、共价结合法； 3 3 包埋法：微囊法、网格法。包埋法：微囊法、网格法。非化学结合法非化学结合法 结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。 分散法：将酶分散于水不溶相中而实现固分散法：将酶分散于水不溶相中而实现固定。定。 超滤反应体系超滤反应体系 离子结合：酶通过离子键结合具

7、有离子交离子结合：酶通过离子键结合具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。换基的水不溶性载体的固定化方法。常常用载体用载体: :DEAE-DEAE-纤维素，纤维素， DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶等。等。使用注意使用注意：pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度吸附法：物理吸附、离子交换吸附法：物理吸附、离子交换 吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而实现每固定化的方法。附在其表面上而实现每固定化的方法。 常用的固体吸附剂：常用的固体吸附剂： 无机载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶无机载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、

8、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、白土、漂瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、白土、漂白土、高岭石、氧化铝、金属氧化物。白土、高岭石、氧化铝、金属氧化物。 天然及合成高分子载体：淀粉、天然及合成高分子载体：淀粉、CMCCMC、DEAE-DEAE-纤纤维素、大孔树脂维素、大孔树脂 非共价作用力，如静电、范德华力、离子键和非共价作用力，如静电、范德华力、离子键和氢键等。氢键等。物理吸附 通过氢键、疏水键、电子亲和力等物理作通过氢键、疏水键、电子亲和力等物理作用用 选择载体的原则选择载体的原则 （1 1）要有巨大的比表面积）要有巨大的比表面积 （2 2） 要有活泼的表面要有活泼的表面 （3 3） 便于装柱进行

9、连续反应。便于装柱进行连续反应。 缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制而容易脱落，所以使用受到一定的限制离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有用的有DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、TEAE-TEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚葡聚糖凝胶等糖凝胶等 。 固定化方法：条件温和，操作简单，在一定固定化方法：条件温和，操作简单，在一定pHpH，T T、离子强度下，酶液与载体混合

10、搅拌几个小时、离子强度下，酶液与载体混合搅拌几个小时/ /酶液流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。酶液流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。 应用：制备过程中，活力损失较少。但是，离应用：制备过程中，活力损失较少。但是，离子键结合力较弱，结合不牢固，在子键结合力较弱，结合不牢固，在pHpH和离子强和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。在酶催化反应度等条件改变时，酶容易脱落。在酶催化反应时，要控制好时，要控制好pHpH、离子强度和温度等条件。、离子强度和温度等条件。吸附吸附法法原理原理载体载体优缺点优缺点物理物理吸附吸附通过氢键、疏水键通过氢键、疏水键和和- -电子亲和力等电子亲和力等物理作用力

11、将酶固物理作用力将酶固定于水不溶性载体定于水不溶性载体无无机机载载体体高岭土、皂土、高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝、微孔玻璃微孔玻璃吸附量较低，多为吸附量较低，多为1mg1mg蛋白蛋白/ /每克吸附剂；易每克吸附剂；易使某些酶发生吸附变使某些酶发生吸附变性性有有机机载载体体纤维素、胶原、纤维素、胶原、以及火棉胶以及火棉胶吸附容量高，通常高吸附容量高，通常高于于50mg50mg蛋白质蛋白质/ /每克胶每克胶原膜；不易使酶发生原膜；不易使酶发生变性变性离子离子交换交换吸附吸附在适宜的在适宜的PHPH和离子和离子强度条件下，利用强度条件下，利用酶的侧链解离基团酶的侧链解离基团和离子交换基团

12、的和离子交换基团的相互作用而达到酶相互作用而达到酶的固定化的固定化CM-CM-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-纤纤维素、维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝葡聚糖凝胶、胶、Amberlitex-97Amberlitex-97、Dowex-50Dowex-50吸附容量大于物理吸吸附容量大于物理吸附，约附，约50-150mg50-150mg蛋白蛋白/ /每克载体每克载体 物理吸附和离子交换吸附的比较物理吸附和离子交换吸附的比较吸附法的优点吸附法的优点不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。固定化操作简单，条件温和，固定化操作简单，条件温和，容易再生，吸

13、附剂可反复使用。容易再生，吸附剂可反复使用。缺点：缺点：作用力弱，容易泄漏，污染产物，作用力弱，容易泄漏，污染产物，载体非专一性结合其他物质载体非专一性结合其他物质被吸附的酶要过量，酶损耗大被吸附的酶要过量，酶损耗大解决途径：解决途径：开发新的载体开发新的载体 根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸附力附力包埋法（包埋法（entrapping methodentrapping method） 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 包埋法分

14、为网格型和微囊型包埋法分为网格型和微囊型 1 1网格型网格型 2 2微囊型微囊型网格型网格型 概念概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法也称为凝胶包埋法p包埋剂：较好的机械强度、半透性、惰性、不与酶发包埋剂：较好的机械强度、半透性、惰性、不与酶发生物理化学变化、包埋后酶活性丧失少等。生物理化学变化、包埋后酶活性丧失少等。p固定微生物细胞最为广泛，多酶体系的包埋。固定微生物细胞最为广泛，多酶体系的包埋。p高分子化合物：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、高分子化合物：聚

15、丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、p天然高分子：淀粉、明胶、海藻酸等。天然高分子：淀粉、明胶、海藻酸等。微囊型包埋法微囊型包埋法 酶包埋在各种高分子聚合物半透膜中制成的小酶包埋在各种高分子聚合物半透膜中制成的小球，制成固定化酶。球，制成固定化酶。 形成的固定化酶小球直径一般几微米至几百微形成的固定化酶小球直径一般几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。米，所以也称为微囊化法。 半透膜的孔径。颗粒比网格型小，有利于底物半透膜的孔径。颗粒比网格型小，有利于底物和产物扩散。和产物扩散。v反应条件要求高，反应条件要求高，成本高成本高v半透膜材料：聚酰半透膜材料：聚酰胺、火棉胶、硝化胺、火棉胶、硝化纤维、聚苯乙烯、纤

16、维、聚苯乙烯、壳聚糖等。壳聚糖等。化学结合法化学结合法 共价键结合法共价键结合法 交联法交联法共价键结合法共价键结合法 （1 1）概念：通过共价键将酶蛋白分子上的反应）概念：通过共价键将酶蛋白分子上的反应基团与载体表面反应基团结合，从而使酶固定基团与载体表面反应基团结合，从而使酶固定化的方法。化的方法。 （2 2）可以形成共价键的基团：）可以形成共价键的基团： 游离氨基，游离氨基， 游游离羧基，离羧基， 巯基，巯基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羟基，羟基， 甲甲硫基，硫基， 吲哚基，二硫键吲哚基，二硫键 （3 3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚

17、物、无机载体，如：纤维素、琼脂糖凝胶、葡物、无机载体，如：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物醇共聚物 共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式” 1.1.首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 2.2.然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 3.3.最后最后, ,活泼基团再与酶分子上某一基团形活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键成共价键载体活化的方法载体活化的方法 A A重氮法重氮法 B B叠氮法叠氮法 C C烷基化反应法烷基化反应法 D D硅烷化法硅烷化法 E E溴化氰法溴化氰法A重氮法重

18、氮法v使用较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（使用较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSEABSE）纤维）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等v载体具有芳香族氨基，苯氨基与亚硝酸生成重氮盐载体具有芳香族氨基，苯氨基与亚硝酸生成重氮盐衍生物，引入活泼的重氮基团。衍生物，引入活泼的重氮基团。v重氮基团与酶分子的酚基、咪唑基发生偶联。重氮基团与酶分子的酚基、咪唑基发生偶联。B B 叠氮法叠氮法 羧基的载体，酯化，与肼基作用生成含有酰肼基团的载羧基的载体，酯化，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成活泼的叠氮化合物，最后于体，再与亚硝酸活化，生成活泼的叠氮化合物，最

19、后于酶偶联。酶偶联。 叠氮基团与酶分子的氨基、羟基、巯基反应，固定化酶。叠氮基团与酶分子的氨基、羟基、巯基反应，固定化酶。如如CM-CM-纤维素、纤维素、葡聚糖、聚氨基葡聚糖、聚氨基酸、乙烯酸、乙烯- -顺丁顺丁烯二酸酐共聚等烯二酸酐共聚等C C烷基化反应法烷基化反应法 首先，含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物首先，含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活泼载体。进行活化，形成含有卤素基团的活泼载体。 然后，与酶分子的氨基、巯基、羟基烷基化反然后，与酶分子的氨基、巯基、羟基烷基化反应偶联固定化酶应偶联固定化酶. .D D 溴化氰法溴化氰法 用溴化氰（用溴化氰（CNBrC

20、NBr）活化多糖类物质。）活化多糖类物质。 载体：如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂载体：如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。糖为载体的占多数（大孔网状结构）。 用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。E硅烷化法v一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。v多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。v耐有机溶剂和微生物破坏耐有机溶剂和微生物破坏, ,载体再生，寿命长

21、。载体再生，寿命长。 共价结合法优点：共价结合法优点： 结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱落，应用和报道最多的一种方法。落，应用和报道最多的一种方法。 缺点：缺点： 反应条件苛刻，操作复杂，反应条件苛刻，操作复杂， 引起高级结构变化，破环活性中心，不易引起高级结构变化，破环活性中心，不易得到比活力高的固定化酶，酶活回收率得到比活力高的固定化酶，酶活回收率30%30%， 底物专一性会发生变化。底物专一性会发生变化。交联法交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作借助双功能试剂使酶分子之

22、间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。固定化。交联法常用试剂交联法常用试剂 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N N，N N乙烯马来亚乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。胺、双重氮联苯胺等。 应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)(shiff)，而交联成，而交联成固定化酶固定化酶 交联法固定化酶的特点交联法固定化酶的特点: :结合牢固，可长

23、时间使用结合牢固，可长时间使用交联反应条件较剧烈，酶分子多个基团被交联，交联反应条件较剧烈，酶分子多个基团被交联，酶活力损失较大酶活力损失较大颗粒较小，使用不便。颗粒较小，使用不便。p通常交联、吸附法或包埋法联合使用，取长补通常交联、吸附法或包埋法联合使用，取长补短。短。（1 1） 吸附交联法吸附交联法（2 2） 交联包埋法交联包埋法 吸附交联法：吸附交联法：酶先吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛酶先吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或大孔离子交换树脂，树脂或大孔离子交换树脂，再用戊二醛等双功能试剂交联，也称壳状固再用戊二醛等双功能试剂交联，也称壳状固定化酶。定化酶。 交联包埋法：交联包埋

24、法：1st step:1st step:酶液和双功能试剂（戊二醛）凝酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的聚合体。结成颗粒很细的聚合体。2nd step2nd step：高分子或多糖类物质包埋成颗粒。：高分子或多糖类物质包埋成颗粒。避免颗粒太细的缺点，固定化酶稳定性好。避免颗粒太细的缺点，固定化酶稳定性好。方法方法优点优点缺点缺点非非化化学学结结合合法法结晶结晶法法提供非常高的酶浓度，对于活力提供非常高的酶浓度，对于活力较低的酶来说具有很大的优越性；较低的酶来说具有很大的优越性；应用时可大大缩短反应时间应用时可大大缩短反应时间在不断重复循环中，酶会有损在不断重复循环中，酶会有损耗，从而使固

25、定化酶浓度降低耗，从而使固定化酶浓度降低分散分散法法通过过滤或离心法将酶与介质完通过过滤或离心法将酶与介质完全分离，进而实现酶的再利用全分离，进而实现酶的再利用酶分散不好将会引起传质效应，酶分散不好将会引起传质效应，使酶的催化活力降低。使酶的催化活力降低。物理物理吸附吸附法法活性中心不易被破坏，高级结构活性中心不易被破坏，高级结构变化少，操作方便，条件温和，变化少，操作方便，条件温和，载体价廉易得、可反复使用等。载体价廉易得、可反复使用等。酶与载体结合力弱，酶容易脱酶与载体结合力弱，酶容易脱落。落。离子离子结合结合法法操作简单、处理条件温和、酶活操作简单、处理条件温和、酶活性中心氨基酸残基和酶

26、高级结构性中心氨基酸残基和酶高级结构不易被破坏，酶的回收率高不易被破坏，酶的回收率高酶与载体结合力弱，容易受缓酶与载体结合力弱，容易受缓冲液或冲液或pHpH的影响，离子强度高的影响，离子强度高时酶易脱落时酶易脱落化化学学结结合合法法共价共价结合结合法法酶与载体结合牢固，不会因底物酶与载体结合牢固，不会因底物浓度高或存在盐而脱落浓度高或存在盐而脱落反应条件苛刻、操作复杂；活反应条件苛刻、操作复杂；活性中心、酶高级结构和酶专一性中心、酶高级结构和酶专一性易受破坏性易受破坏交联交联法法比较牢固，可长时间使用比较牢固，可长时间使用反应条件激烈，酶多个基团被反应条件激烈，酶多个基团被交联，活力损失大，颗

27、粒小交联，活力损失大，颗粒小固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的

28、固定化结合的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。件下进行。固定化酶的性质及其影响因素 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化 评价固定化酶的指标评价固定化酶的指标影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素 1.1.酶本身的变化，酶本身的变化， 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状主要是

29、由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。态等发生了变化。 2 2固定化方法的影响固定化方法的影响 3.3.载体的影响载体的影响 固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层，固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层，以及静电的相互作用等引起的变化。以及静电的相互作用等引起的变化。 （1 1） 分配效应分配效应 （2 2） 空间障碍效应空间障碍效应 （3 3） 扩散限制效应扩散限制效应 4.载体与酶直接作用：载体与酶直接作用： 活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化 固定化对酶活性的影响：固定

30、化对酶活性的影响： 固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响 pHpH的变化的变化 最适温度变化最适温度变化 底物特异性变化底物特异性变化 米氏常数米氏常数KmKm的变化，的变化，KmKm值随载体性质变化值随载体性质变化1 1 固定化对酶活性的影响固定化对酶活性的影响 酶活性下降，反应速度下降酶活性下降，反应速度下降 原因：原因：酶结构的变化、构象变化，影响活性中心氨基酶结构的变化、构象变化，影响活性中心氨基酸酸空间位阻：活性中心对底物的定位空间位阻：活性中心对底物的定位内扩散阻力：底物与活性中心的接近内扩散阻力：底物与活性中心的接近包埋时被高分子物质半透膜包围，大分子底物包埋时被高分子物

31、质半透膜包围，大分子底物难以进去。难以进去。p个别情况：酶活提高，化学偶联使得到化学修个别情况：酶活提高，化学偶联使得到化学修饰。饰。2 2 固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响 （1 1）操作稳定性提高）操作稳定性提高 （2 2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。）贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3)(3)热稳定性，大多数升高，有些反而降热稳定性，大多数升高，有些反而降低。低。 (4(4）对分解酶的稳定性提高。）对分解酶的稳定性提高。 （5）pH稳定性提高，明显优于游离酶稳定性提高，明显优于游离酶 （6）对有机溶剂的稳定性提高）对有机溶剂的稳定性提高p稳定性提高的原因：稳定性提高的原因

32、：固定化后酶稳定性提高的原因：固定化后酶稳定性提高的原因：酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形，增加了酶活性构象的牢固程度形，增加了酶活性构象的牢固程度酶活力的释放是缓慢的。酶活力的释放是缓慢的。酶与载体结合后，失去了分子间的相互作用酶与载体结合后，失去了分子间的相互作用的机会，抑制了酶自降解的机会，抑制了酶自降解，提高了酶稳定性。，提高了酶稳定性。阻挡了不利因素对酶的侵袭阻挡了不利因素对酶的侵袭限制了酶分子间的相互作用，但若固定化触限制了酶分子间的相互作用，但若固定化触及到酶的活性敏感区，也可能导致酶的稳定及到酶的活性敏感区，也可能导致酶的稳定性下降

33、。性下降。 pH的变化 pHpH对酶活性的影响：对酶活性的影响： （1 1） 改变酶的空间构象改变酶的空间构象 （2 2）影响酶的催化基团的解离）影响酶的催化基团的解离 （3 3）影响酶的结合基团的解离）影响酶的结合基团的解离 （4 4）改变底物的解离状态，酶与底物）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。不能结合或结合后不能生成产物。pH对固定化酶的影响 载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。 载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。v微环境是指在固定化微环境是指在固定化酶附近的局部环境，酶附近的局部环境，v而把主体

34、溶液称为宏而把主体溶液称为宏观环境。观环境。 最适温度变化最适温度变化 随热稳定性的提高，最适温度随之提高随热稳定性的提高，最适温度随之提高 少数例外，最适温度下降，活性或其他因素会改善少数例外，最适温度下降，活性或其他因素会改善 底物特异性变化底物特异性变化 专一性会发生不同程度的变化专一性会发生不同程度的变化 作用于小分子底物的酶：特异性没有明显变化作用于小分子底物的酶：特异性没有明显变化 既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶：既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶：特异性往往会变化。特异性往往会变化。米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体性质变值随载体性质变化化

35、米氏常数反映酶与底物的亲合力：米氏常数反映酶与底物的亲合力： KmKm升高，酶与底物的亲和力降低升高，酶与底物的亲和力降低 载体的带电性能影响载体的带电性能影响KmKm变化变化( (电中性载体，扩散限电中性载体，扩散限制使表观制使表观KmKm上升上升) )。 带电载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散带电载体与底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和整个溶液之间不均一分布：层和整个溶液之间不均一分布：（1 1） 载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，KmKm KmKm 固定化酶降低了酶的亲和力。固定化酶降低了酶的亲和力。（2 2） 载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反

36、，静电作用，KmKmKmKm评价固定化酶的指标： 1. 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（有的酶活力单位。或：单位面积（cmcm2 2）的酶活）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（力一半所需要的时间（t t1/21/2） 3. 酶结合效率酶结合效率v4. 4. 酶活力回收率酶活力回收率（或称偶联效率，活力保留百分数

37、）（或称偶联效率，活力保留百分数）四 固定化酶的活力测定方法介绍1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的加入一定量的底物溶液，底物溶液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。取出一定量的反应液进行酶活力测定。2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流收集流出的反应液出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量测定其中产物的生成量或底物的消耗量

38、 3. 3. 连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。酶活力。 固定化细胞 固定在载体上并在一定的空间范围内进行固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞生命活动的细胞称为固定化细胞. 该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的特点保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，保证保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，保证了细胞的代谢途径和代谢调控了细胞的代谢途径和代谢调控发酵稳定性好，可反复使用；发酵稳定性好，可反复使用；固定化细胞密度提高，可以提高产率；固定化细胞密度提高，可以提高产率；提高了工程菌的质粒稳定性提高了工程菌的质粒稳定性细胞固定化方法 吸附法 包埋法v