38微生物表面擦拭方法验证报告

1、微生物棉签擦拭取样方法及检验方法验证报告文件编号：VP-01-06-00-038起草人日期审核人日期批准人日期重庆麦克福新制药VP-01-06-00-038共11页1、概述微生物在适当的温湿度下以残留物中的有机物为营养可大量繁殖，产生各种代谢物，从而大大增加残留物的复杂性和危害程度，对下批产品造成污染。因此必须对药品生产设备的微生物进行严格控制。制药企业的生产场所、设备、用具等在生产结束后需清洁，根据GMP勺要求，清洁后应对清洁效果进行评价，设备表面微生物限度检查应符合要求，擦拭取样优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的表面微生物限度评价设备的清洁状况。对棉签擦拭取样

2、方法和检验方法的可行性进行验证，确保清洁方法的有效性，降低药品交叉污染和微生物污染的风险。2018年08月19日至8月31日，根据经批准的微生物棉签擦拭取样方法及检验方法验证方案（编号：VP-01-06-00-037）,验证小组对微生物棉签擦拭取样方法及检验方法进行了验证，验证过程包括擦拭取样、菌悬液制备、回收率试验。在验证过程中严格按照验证方案及验证计划进行了验证，其验证方案在验证过程中没有修改，验证结果完整、真实，验证达到预期的效果。2、验证依据：中华人民共和国药典2015版四部3、验证目的通过对清洗消毒后微生物取样方法的回收率试验，评价取样方法的有效性、代表性和科学性，并为证明清洗方法有

3、效性提供基本依据。4、范围本次验证适合微生物棉签擦拭法取样。5、验证小组成员及职责表1验证小组成员及职责人员姓名职位职责组长吴涛QC负责人负责验证方案和报告的审核及实施过程监督。成员彭雪梅QA负责验证过程的监控和检查，保证验证方案的实施谭裴QC1、负责验证方案及报告的起草2、负责检验操作，数据的收集、记录的填写李树冰QC协助验证方案及报告的起草，负责对验证数据的复核。6、验证方案的实施情况1.1 证前的准备1.1.1 主要验证用仪器仪表的确认1.1.1.1 确认方法：查看手提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜校验日期，确定是否在有效期内；1.1.1.2 可接受

4、标准：确认提式压力蒸汽灭菌锅、生化培养箱、霉菌培养箱、电热恒温干燥箱、生物安全柜已经过校验，校验合格。1.1.1.3 设备检定情况确认结果表2设备检定确认表仪器名称规格型号检定情况检定部门手提式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-18SIAA生化培养箱SHP-250莓园培乔箱BMJ-250电热恒温干燥箱DHG-9141A生物安全柜BHC-800H-A2结论检查人/日期复核人/日期1.1.2 试验环境确认1.1.2.1 确认方法：查看阳性对照室、生物安全柜的环境监测报告，确认悬浮粒子、风速、沉降菌、浮游菌、表面微生物是否符合GM嗖求。1.1.2.2 可接受标准：确认悬浮粒子、风速、沉降菌、浮游菌、表面微

5、生物符合GM嗖求。1.1.2.3 试验环境确认结果表3试验环境的确认项目风速悬浮粒子沉降菌浮游菌表面微生物阳性检测室生物安全柜结论检查人/日期复核人/日期1.1.3 验证用菌种及培养基表4菌种确认菌种名称编号来源购进日期大肠埃希菌CMCC(B)44102中国药品生物制品检定研究院金黄色葡稳球菌CMCC(B)26003中国药品生物制品检定研究院枯草芽抱杆菌CMCC(B)63501中国药品生物制品检定研究院白色念珠菌CMCC(B)98001中国药品生物制品检定研究院黑曲霉CMCC(B)98003中国药品生物制品检定研究院结论检查人/日期复核人/日期表5培养基确认6.1.4人员培训培养基、缓冲液名称

6、干粉批号配制批号干粉来源胰酪大豆陈琼脂培养埴胰酪大豆豚液体培养埴沙氏葡锢糖琼脂培养埴沙氏葡锢糖液体培养埴麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培乔基检查人/日期复核人/日期验证操作人员应在验证实施前应对其批准的验证方案进行培训，确保验证人员能依照验证方案正确实施。培训时间培训人参加培训人员溯源资料确认人/日期复核人/日期1.2 验证项目和验证方法1.2.1 试验菌株表面微生物擦拭取样方法及检验方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。1.2.2 试验菌悬液的制备1.2.2.

7、1 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌新鲜培养物至胰酪大豆陈琼脂培养基中，于3035C培养1824,接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基中，于2025C培养4872h,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数50100cfu的菌悬液；1.2.2.2 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡糖糖琼脂培养基上，2025C培养57d,加入35mL0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，然后用管口带有无菌棉花的无菌毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数（抱子数）50100cfu的菌（抱子）悬液。1.2.2.3 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应

8、在2小时之内使用。1.3 擦拭取样法的验证1.3.1 供试组制备1.3.1.1 取50mnrK50mmf锈钢材质的无菌擦片，用已校验的1mL移液管吸取检定菌悬液1mL均匀涂布于无菌擦片上，并于层流台下吹干，取无菌棉签1支，用无菌的0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。握住棉签柄，在取样点处选择约为25cm2以300角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭（见图1）,然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于20mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，充分振摇5min，做好标识，作为供试品溶液。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。1.3.1.2 取全部供试品溶液，经

9、薄膜法过滤后，用pH=7.0氯化钠-蛋白冻缓冲液50mL冲洗滤膜，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于3035C培养72h、2025c培养120h,记录各平皿上菌落数。图1擦拭示意图1.3.2 菌液组制备吸取菌悬液1mL加入0.9%无菌氯化钠溶液20mL中，全部经薄膜过滤法过滤，用PPH7.0氯化钠-蛋白冻缓冲液50mL冲洗滤膜，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于3035C培养72h、2025C培养120h,记录各平皿上菌落数。1.3.3 阴性对照组制备取0.9%无菌氯化

10、钠溶液20mL代替供试品溶液，其它操作同6.3.1.21.3.4 回收率计算回收率以3次实验测试值的平均值计。1.3.5 可接受标准回收率>70%,RStM20%1.3.6 擦拭取样法验证实验结果（见附件1）1.3.7 结论：1.4 微生物限度检验方法学验证1.4.1 供试组制备取50mmx50mm锈钢材质的无菌擦片，取无菌棉签1支，用无菌的0.9%氯化钠溶液浸湿，并将其靠在锥形瓶口上挤压至无多余的浸润剂滴落。握住棉签柄，在取样点处选择约为25cm2以30。角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭（见图1）,然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于20mL的0.9%无菌氯化钠溶

11、液中，充分振摇5min,做好标识，作为供试品溶液。平行制备两个不锈钢载片。取供试液20mL,菌悬液1mL经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于3035C培养72h、2025c培养120h,记录各平皿上菌落数。1.4.2 菌液组制备取pH=7.0氯化钠蛋白冻缓冲液100mL加入薄膜过滤器中，过滤。取缓冲液20mL,菌悬液1mL经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，平行制备2个平皿，分别于3035C培养72h、2025c培养120h,记录各平皿上菌落数。1.4.3 阴性

12、对照组制备取0.9%无菌氯化钠溶液20mL,经薄膜过滤法过滤，将滤膜取出，菌面朝上分别贴于胰酪大豆陈琼脂培养基平皿及沙氏葡糖糖琼脂培养基平皿上，分别于3035C培养72h、2025c培养120h,记录各平皿上菌落数。1.4.4 回收率计算回收率以3次实验测试值的平均值计。1.4.5 可接受标准回收率应70%RStM20%。1.4.6 微生物限度检验验证实验结果（见附件2）1.4.7 结论：7 .再验证建议：若该产品的组分或原检验条件发生改变时，需重新确认8 .验证结果评价及结论：9 .附件清单附件1擦拭取样法验证实验结果附件2微生物限度检验验证实验结果附件3验证报告批准书附件1擦拭取样法验证实

13、验结果验证实验细菌酵母菌|毒困验证次数实验组大肠埃希|菌（10-7）金黄色有萄球菌枯草芽抱杆菌（10-5）|白色念珠菌（10-5）J|黑曲霉(10-7)(10-6)平皿1212121212供试品组1菌液组阴性对照回收率（%平皿1212121212供试品组2菌液组阴性对照回收率（%平皿1212121212供试品组3菌液组阴性对照回收率（%回收率平均值（%RSD(%)试验人/日期复核人/日期附件2微生物限度检验验证实验结果验证实验细菌酵母菌|毒困验证次数实验组大肠埃希1金黄色春枯草芽抱。色念珠|黑曲霉菌(10-7)萄球菌杆菌（105）1直(10-5)(10)(10-6)平皿1212121212供试品组1菌液组阴性对照回收率（%平皿1212121212供试品组2菌液组阴性对照回收率（%9平皿1212121212供试品组3菌液组阴性对照回收率（%9回收率平均值（%RSD(%)试验人/日期复核人/日期附件3验证