生脉拆方系列注射液的制备及质量标准研究

1、生脉拆方系列注射液的制备及质量标准研究    【摘要】  目的 对生脉注射液不同拆方配伍制备的注射液进行制备工艺及质量标准研究,为生脉注射液在体药物配伍关系研究提供物质基础及质量保证。方法 参照生脉注射液制备方法,规范了7种注射液的制备工艺,并采用HPLC及TLC法分别对系列注射液人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、五味子醇甲及麦冬药材进行定量或定性分析。结果 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re在0.942 49.424 g与0.6246.24 g范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系(r10.999 5、r20.999 7),平均回收率为

2、97.0%100.4%,RSD为0.45%3.44%。TLC检出人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、五味子醇甲成分及麦冬对照药材主斑点。结论 本试验确定的制备工艺稳定,质量控制方法便捷,结果准确可靠、重现性好,可为生脉注射液在体药物配伍关系研究提供试验基础与保证。 【关键词】  生脉注射液；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；五味子醇甲；高效液相色谱法；薄层色谱法     Abstract：Objective To study the preparation and quality standard of seri

3、es of Shengmai Injection, and supply substantial basis and quality assurance for compatibility relation research on traditional Chinese medicine in vivo. Methods According to the preparing process of Shengmai Injection, preparing processes for 7 dismantlement injections were established. HPLC and TL

4、C methods were used for qualitative analysis and quantitation determination of Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Re, Ginsenoside Rb1, Schisandrin and Radix Ophiopgonis. Results The linear ranges of Ginsenoside Rg1 and Ginsenoside Re were 0.942 49.424 g (r0.999 5) and 0.6246.24 g (r0.999 7). The average r

5、ecovery was 97.0%100.4%, and RSD was 0.45%3.44%. The main spots of Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Re, Ginsenoside Rb1, Schisandrin and Radix Ophiopgonis were identified by TLC method. Conclusion The preparation processes are stable. The method of quality control was showed rapid, reliable and well rep

6、roducible. It set a good basis for the compatibility study on Shengmai Injection in vivo.    Key words：Shengmai Injection；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Ginsenoside Rb1；Schisandrin；HPLC；TLC     探讨中药复方发挥整体效应的物质基础及药味配伍关系是现代中药学研究的热点。为了开展此方面的研究工作,本试验选定生脉注射液为示范性研究制剂。在统一

7、药材批次、固定处方比例、规范制备条件的前提下,参照卫生部药品标准(中药成方制剂)“生脉注射液”项下制备方法1,分别制备7种注射液,并制定其质量控制标准,为方中红参、麦冬、五味子3味中药群体组分在体研究的均一性和可比性提供基本保障,同时为方中药味在体生脉注射液指纹谱的识别与归属、色谱峰的消长变化与药物配伍关系的评定提供良好的物质基础和技术保证。 1  仪器与试药     Waters高效液相色谱仪(美国),LC-10UV检测器,JS-3030型色谱工作站。人参皂苷Rg1(批号110703-200424)、人参皂苷Re(批号110754-

8、200421)、人参皂苷Rb1(批号110704- 200420)、五味子醇甲(批号110857-200507)、麦冬对照药材(批号121013-200607),均由中国药品生物制品检定所提供；生脉系列注射液由辽宁省中医药研究院药学研究室制备。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,磷酸及其他试剂均为分析纯。 2  生脉系列注射液的制备 2.1  红参注射液     取红参100 g,粉碎成细粒,用乙醇回流提取5次,每次2 h,合并提取液,冷藏,滤过,滤液浓缩至稠膏状。加入注射用水至400 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加注射用

9、水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.2  麦冬注射液     取麦冬312 g,加水煎煮3次,每次40 min。合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行2次醇沉,第1次使含醇量达80%,第2次使含醇量达85%。滤过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状。加入注射用水约200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸30 min,稍冷,过滤至澄明,加注射用水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.3  五味子注射液  

10、   取五味子156 g,水蒸气蒸馏法收集馏液150 mL,冷藏,供配液用。药渣加水煎煮3次,每次40 min。合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行两次醇沉,第1次使含醇量达80%,第2次使含醇量达85%。滤过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状。加入注射用水至200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸30 min,稍冷,过滤至澄明,滤液加入蒸馏液及注射用水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.4  参味注射液     取红参100 g、五味子156 g,分别按

11、照“2.1”、“2.3”项下方法制备至“加注射用水至1 000 mL”前。合并上述红参水液、五味子蒸馏液、五味子水液,混合均匀,滤过,滤液加注射用水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.5  参麦注射液     取红参100 g、麦冬312 g,分别按照“2.1”、“2.2”项下方法制备至“加注射用水至1 000 mL”前。合并上述红参水液、麦冬水液,混合均匀,滤过,滤液加注射用水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.6  麦味注射液 

12、;   取麦冬312 g、五味子156 g,分别按照“2.2”、“2.3”项下方法制备至“加注射用水至1 000mL”前。合并上述麦冬水液、五味子蒸馏液、五味子水液,混合均匀,滤过,滤液加注射用水至1 000mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 2.7  生脉注射液     取红参100 g、麦冬312 g、五味子156 g,将红参粉碎成细粒,用乙醇回流提取5次,每次 h,合并提取液,冷藏,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入注射用水至400 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液供配液用；五味子用水蒸气蒸馏法收集

13、馏液150 mL,冷藏,供配液用,药渣加水煎煮3次,每次40 min,合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行2次醇沉,第1次使含醇量达80%,第2次使含醇量达85%,滤过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入注射用水至200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸30 min,稍冷,过滤至澄明,供配液用。麦冬照五味子水液制备方法制成澄明的麦冬水溶液约200 mL,供配液用。将上述红参水液、五味子蒸馏液、五味子水液和麦冬水液混合均匀,滤过,滤液加注射用水至1 000 mL,调节药液pH值至7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。 3  生脉系列注射液质量标准研究

14、60;3.1  定性鉴别 3.1.1  红参  分别取生脉注射液、参麦注射液、参味注射液、红参注射液5 mL,水浴蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品,加乙醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液,作为对照品溶液。照2005年版中华人民共和国药典附录B试验,精密吸取上述5种溶液各24 L,分别点于同一硅胶薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15402210)10 以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 烘数分钟,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品

15、色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。 3.1.2  麦冬  分别取生脉注射液、参麦注射液、麦味注射液、麦冬注射液40 mL,加盐酸3 mL,置水浴中加热1 h,放冷,加乙醚振摇提取2次,每次30 mL,合并醚液,蒸干,残渣加三氯甲烷1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取麦冬对照药材2 g,加水煎煮30 min,滤过,滤液浓缩至约40 mL,同法制成对照药材溶液。照2005年版中华人民共和国药典附录B试验,吸取上述5种溶液各510 L,分别点于同一硅胶薄层板上,以三氯甲烷-丙酮(41)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,

16、在105 烘约5 min。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。 3.1.3  五味子  分别取生脉注射液、参味注射液、麦味注射液、五味子注射液50 mL,水浴浓缩至约25 mL,移至分液漏斗中,加三氯甲烷振摇提取3次,每次10 mL,滤过,合并滤液,水浴蒸至近干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取五味子醇甲对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照2005年版中华人民共和国药典附录B试验,吸取上述供试品溶液45 L、对照品溶液12 L,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(3060 )-甲酸

17、乙酯-甲酸(1451)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。 3.2  含量测定 3.2.1  色谱条件  色谱柱：XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 m)；柱温：常温；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(1981)；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；理论塔板数按人参皂苷Rg1色谱峰计应不低于5 000。 3.2.2  对照品溶液的制备  精密称取在五氧化二磷干燥器

18、中干燥至恒重的人参皂苷Rg1 23.52 mg和人参皂苷Re 15.60 mg,置25 mL量瓶中,加乙腈-水(1981)至刻度,摇匀,精密量取5 mL置10 mL量瓶中,加乙腈-水(1981)稀释至刻度,摇匀,即得(每1 mL含人参皂苷Rg1 0.471 2 mg、人参皂苷Re 0.312 mg)。 3.2.3  供试品溶液的制备  分别精密量取生脉注射液、参麦注射液、参味注射液、红参注射液各25 mL,水浴蒸干,残渣加流动相溶解,并定量转移至5 mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。 3.2.4  线性关系考察 

19、 精密吸取混合对照品溶液2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 L,注入高效液相色谱仪。以进样量为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程：YRg11.422×10-6XRg10.091 2(r0.999 5)；YRe1.676×10-6XRe0.036(r0.999 7)。结果表明：人参皂苷Rg1与人参皂苷Re进样量分别在0.942 49.424 g、0.6246.24 g范围内与峰面积呈良好线性关系。 3.2.5  精密度试验  精密吸取同一样品供试品溶液20 L,连续进样6次,测定人参皂苷Rg1与人参皂苷R

20、e峰面积。结果4种样品2种成分峰面积精密度RSD在1.32%1.58%范围内,说明精密度良好。 3.2.6  稳定性试验  取每种注射液同一样品供试液,分别于0、2、4、6、8 h检测。结果人参皂苷Rg1与人参皂苷Re测定在8 h内稳定,RSD在1.29%1.83%范围内。 3.2.7  重复性试验  取每种注射液同一批样品,精密吸取6份,平行制备供试品溶液并进样测定。结果RSD在1.79%2.95%范围内。 3.2.8  加样回收率试验  采用加样回收法。精密称定4种注射液已知含量的同一批样品9份,每份12.5 mL,每3份1组,分别按样品含量80%、100%、120%加入对照品溶液(人参皂苷Rg1 0.471 2 mg/mL；人参皂苷Re 0.312 mg/mL),制备供试品溶液,测定,结果平均回收率在97.0%100.4%,RSD在0.45%3.44%范围内。结果见表1。表1  加样回收率试验结果（略） 3.2.9  样品含量测定 精密吸取对照品溶液10 L、各供试品溶液20 L,分别注入液相色谱仪,测定,计算,即得。色谱图见图1。含量测定结果见表2