土壤酶测定方法

1、土壤酶活性测定方法王强锋土壤脲酶的测定方法苯酚钠次氯酸钠比色法一、原理 脲酶存在于大多数细菌、 真菌和高等植物里。 它是一种酰胺酶作用是极为专性的， 它仅能水 解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机 物质含量、 全氮和速效磷含量呈正相关。 根际土壤脲酶活性较高， 中性土壤脲酶活性大于碱 性土壤。 人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基 质经酶促反响后测定生成的氨量，也可以通过测定 未水解的尿素量来求得。本方法以尿素 为基质，根据酶促产物氨与苯酚 次氯酸钠作用生成 蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。二、试剂1甲苯 2 10%

2、尿素：称取 10g 尿素，用水溶至 100ml。 3柠檬酸盐缓冲液 PH6.7： 184g 柠檬酸和 147.5g 氢氧化钾 KOH 溶于蒸馏水。将两溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。4苯酚钠溶液1.35mol/L： 62.5g苯酚溶于少量乙 醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀释至 100mlA 液，存于冰箱中； 27gNaOH 溶 于100ml水B液。将A、B溶液 保存在冰箱中。使用前将 A液、B液各20ml混合，用 蒸馏水稀释至 100ml 。 5次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6氮的标准溶

3、液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释 10倍吸取10ml标准液定容至 100ml丨制成氮的工 作液 0.01mg/ml。三、操作步骤称取5g 土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和 20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37C恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取 1ml 滤液参加 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇 匀。 20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计与 578nm 波长处比色。 靛酚的蓝色在

4、1h 内 保持稳定。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ml氮工作液，移于 50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再参加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠 溶液，随加随摇匀。 20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计上于 578nm 波长 处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。考前须知: 1、每一个样品应该做一个无基质对照， 以等体积的蒸馏水代替基质， 其他操作与样品 实验相同， 以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同， 以检验试剂纯 度和

5、基质自身分解。 3、如果样品吸光值超过标曲的 最大值，那么应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：以24 小时后 1g 土壤中NH3 N的毫克数表示土壤脲酶活性 UreUre= a样品a无土 a无基质XVXn/ m式 中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3 N毫克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的 NH3 N毫克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3 N毫克数； V 为显色液体积； n 为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积； m 表示烘干土重 土壤磷酸酶活性测定磷酸苯二钠比色法、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。 前一种通常

6、称为有 有机基团含量法， 是目前较为常用的测定磷酸酶的方法， 后一种称为无机磷含量法。 研究证 明：磷酸酶有三种最适PH 值： 45、 67、 810。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸 酶，要提供相应的 PH 缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。 测定磷酸酶常用的 PH 缓冲体系有乙酸盐缓冲液 、柠檬酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、和 硼酸缓冲液 PH910 。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、 a或者 伊萘酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。二、试剂1缓冲液：1醋酸盐缓冲液醋酸溶液11.55ml 95%冰醋酸溶至1L。醋酸钠溶液2H3O2W 或27g C2H

7、3O2Na.3H2O溶至1L.取醋酸溶液和醋酸钠溶液稀释至1L. 2柠檬酸盐缓冲液柠檬酸溶液6H7O8溶至磷酸氢二钠溶液 Na2HPO4 .7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L. 取柠檬酸溶液加磷酸氢二钠溶液稀释至100ml. 3硼酸盐缓冲液硼砂溶液硼砂溶至1L.溶液 8gNaOH 溶至 1L. 取硼砂溶液加溶液稀释至 200ml. 2 0.5%磷酸苯二钠用缓冲液配 制3氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4甲苯 50.3%硫酸铝溶液6酚标准溶液 酚原液：取1

8、g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液：取 10ml 酚原液稀释至 1L。三、操作步骤称 5g 土样置于 200ml 三角瓶中，加 2.5ml 甲苯，轻摇 15min 后，参加 20ml 0.5%磷酸 苯二钠 酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液； 中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液； 碱性磷酸酶用硼酸盐 缓冲液，仔细摇匀后放入恒温箱，37C下培养24h。然后在培养液参加 100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取 3ml 滤液于 50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓 冲 液时，呈现蓝色，于分光光度计上 660nm 处比色。 标准曲线绘制：取 0、1、3、5、7、 9、11

9、、13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，每瓶参加 5ml 硼酸缓冲液和 4 滴氯代二溴 对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度， 30min 后，在分光光度计上 660nm 处比色。以显色 液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。考前须知 : 1、每一个样品应该做一个无基质对照， 以等体积的蒸馏水代替基质， 其他操作与 样品实验相同， 以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样， 其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，那么应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算以24h后1g 土壤中释放出的

10、酚的质量mg表示磷酸酶活性。磷酸酶活性=a样品a无土一 a无基质XVXn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数； V 为显色液体积； n 为分取倍数， 浸出液体积/吸取滤液体积； m 表示烘干土 重 土壤蔗糖酶活性测定 3,5- 二硝基水杨酸比色法、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的复原糖与3,5- 二硝基水杨酸反响而生成橙色的3-氨基 -5-硝基水杨酸。 颜色深度

11、与复原糖量相关，因而可用测定复原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1酶促反响试剂： 基质8%蔗糖，磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠11.876g W2HPO4 2H2O 溶于1L蒸馏水中加1/15M磷酸二氢钾9.078g KH 2PO4溶于1L蒸馏水中9.5ml即成， 甲苯2葡萄糖标准液1mg/mL丨预先将分析纯葡萄糖置80C烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀冰箱中4 C保存期约一星期。假设该溶液发生混浊和出现絮状物现象，那么应弃之，重新配制。3 3,5-二硝基水杨酸试剂 DNS 试剂称二硝基水杨酸，溶于 20ml 2mol/LNa

12、OH 和 50ml 水中， 再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml保存期不过 7天。三、操作步骤1 标准曲线绘制 分别吸 1mg/mL 的标准葡糖糖溶液 0、于试管中，再补加蒸馏 水至1mL ,加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反响 5min从试管放入重新沸腾时 算起，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以 OD值为纵坐标，以葡 萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 2土壤蔗糖酶测定 称取 5g 土壤，置于 50mL 三角瓶中，注入 15ml 8%蔗糖溶液， 5ml pH 5.5 磷酸缓冲液 和5滴甲苯。摇匀 混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取

13、出，迅速过滤。从中吸取滤液 1ml,注入50ml容量瓶中，加3ml DNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min,随 即将容量瓶移至自来水流下冷却 3min。溶液因生成 3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至 50ml ，并在分光光度计上于 508nm 处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、 葡萄糖而引起的误差， 每一土样需做无基质对照， 整个试验需做无土壤对照； 如果样品吸光 值超过标曲的最大值，那么应该增加分取倍数或减少培养的土样。四、结果计算：蔗糖酶活性以24h， 1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。 结果计算：蔗糖酶活性=a样品a无土 a无基质h/m a样品、a无土、a无机质

14、分别表示其 由标准曲线求的葡萄糖毫克数； n 为分取倍数； m 表示烘干土重 土壤纤维素酶活性测定 3,5- 二硝基水杨酸比色法一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下， 它的最 初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的复原糖与3,5- 二硝基水杨酸反响而生成橙色的 3-氨基 -5-硝基水杨酸。颜色深度与复原糖量相关，因而可用测定复原糖量来表示蔗糖 酶的活性。二、试剂1甲苯 2 1%羧甲基纤维素溶液： 1g 羧甲基纤维素钠，用 50%的乙醇溶至 100ml。 3 pH5.5

15、醋酸盐缓冲液：醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27.22g C2H3O22O溶至1L.取醋酸溶液和醋酸钠溶液混匀即成醋酸盐缓冲液 .43,5-二硝基水杨酸溶液： 称二硝基水杨酸， 溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中， 再加 75g 酒石酸 钾钠，用水稀释至 250ml保存期不过 7天，5葡萄糖标准液1mg/mL丨预先将分析 纯葡萄糖置80 C烘箱内约12小时。准确称取 50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后， 移至50mL容量瓶中，定容，摇匀冰箱中4 C保存期约一星期。假设该溶液发生混浊和出现絮状物现象，那么应弃

16、之，重新配制。三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸 1mg/mL 的标准葡糖糖溶液 0、 0.8mL 于试管中，再补 加蒸馏水至1mL ,加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热 5min ,取出立即泠水浴中 冷却至室温，以空白管调零在波长 540nm 处比色，以 OD 值为纵坐标，以葡萄糖 浓度为 横坐标绘制标准曲线。 称 10g 土壤置于 50ml 三角瓶中，参加 1.5ml 甲苯，摇匀后放置 15min，再加5ml 1%羧 甲基纤维素溶液和 5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37 C恒温箱中培养 72h。培养结 束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测 定。 为了

17、消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整 个试验需做无土壤对照；如果样 品吸光值超过标曲的最大值，那么应该增加分取倍数或减少 培养的土样。 四、结果计算 纤维素酶活性以 72h， 1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性 =a 样品 a 无土 a无基质xn/ m a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数； n 为分取倍数； m 表示烘干土重 过氧化氢酶活性测定高锰酸钾滴定法一、原理过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中， 是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反响的结 果产生的， 这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。 与此同时， 在生物体和土壤

18、中存有过 氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反响H2O2T H2O+O2，从而降低了过氧化氢的毒害作用。 土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤 含有过氧化氢酶 和过氧化氢作用析 出的氧气体积或过氧化氢的消耗量， 测定过氧化氢的分解速度， 以此代表过氧化氢酶的活性。 测定过氧化氢酶的具体方法比拟多， 如气量法： 根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活 性； 比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活 性；滴定法： 用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反响剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。二、试剂2mol/L H 2SO4溶液量取5.43ml的浓硫酸稀释至 500ml，置于冰箱贮存高锰酸钾溶液：称取 高锰酸钾，参加 400mL水中，缓缓煮沸 15min，冷却后定容至 500mL，避光保存，用时 用草酸溶液标定；草酸溶液：称取优级纯H2C2O4?2H2O 3.334g,用蒸馏水溶解后，定容至250ml; 3%的H2O2水溶液：取 30% H2O2溶液25ml，定容至 250ml，置于冰箱贮存， 用时用MnO4溶液标定。三、操作步骤 操作步骤分别取5g 土壤样品于具塞三角瓶中用不加土样的作空白对照，参加甲苯，摇匀，于4C冰箱中放置 30min。取出，立刻参加 25mL冰箱贮存的3% H2O2水溶液，充分混匀后，再 置于冰箱