反相高效液相色谱法测定冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量

1、反相高效液相色谱法测定冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量         【摘要】  目的建立反相高效液相色谱（RPHPLC）法测定冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量。方法色谱柱为NUCLEODUR C18 RP柱(250 mm× 4.6 mm, 5 m)；流动相为甲醇水(8713)；流速0.8 ml·min-1，光电二极管阵列检测器，检测波长210 nm，柱温25 。结果在选定色谱条件下线性范围良好，乌索酸和齐墩果酸的样品加样回收率分别为96.2%和98.7%，RSD为1.9%和0.9%。结

2、论该方法快速简便，结果准确可靠。 【关键词】  冬凌草； 乌索酸； 齐墩果酸； 反相高效液相色谱； 含量测定基金项目：国家“863”计划重点资助项目Abstract：ObjectiveTo develop a quantitative method for determination of ursolic acid and oleanolic acid in Rabdosia rubescens by RPHPLC. MethodsHPLC was carried out on NUCLEODUR C18 RP column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at

3、25 using methanolwater (8713) as mobile phase with a flow rate of 0.8 ml·min-1 and detection wavelength was at 210 nm.  ResultsThe good linear relationship was obtained under the optimum conditions. The recoveries of the standards added for ursolic acid and oleanolic acid were 96.2 % and 9

4、8.7%, respectively, while the relative standard deviations were 1.9 % and 0.9%.ConclusionThe method is rapid and precise.Key words：Rabdosia rubescens;  Ursolic acid;  Oleanolic acid ;  RP-HPLC;  Content determination   冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米亚Rabdosia rubescens (Hemsl.)Hara的干燥全

5、草，广布于黄河、长江流域，主产地在河南济源太行山一带。冬凌草味甘、苦，性微寒，具清热解毒，消炎止痛，健胃活血及抗肿瘤之功效1。用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤及食管癌、贲门癌、肝癌、乳腺癌等。临床实验证明冬凌草对食管癌、贲门癌、肝癌等有一定疗效，对食管上皮增生有显着疗效2。1991年我国卫生部批准将其干燥叶及地上部分作为中药材，收入部颁中药材标准。冬凌草中的主要有效成分为冬凌草甲素、冬凌草乙素、乌索酸和齐墩果酸。近年药理研究表明,不仅冬凌草甲乙素具有很强的抗癌作用,乌索酸和齐墩果酸也具有一定的抗肿瘤活性35。笔者采用反相高效液相色谱法同时测定了不同产地冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量，为控制

6、药材质量提供依据。1  仪器与材料   Waters高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管矩阵检测器，7725I 进样阀，Empower 中文色谱工作站），ROMB10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂），CP225D分析天平（德国Sartorius公司），FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），20226A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司），KS1500超声提取仪器（宁波科盛仪器厂）。   甲醇为色谱纯（色谱纯，上海陆忠试剂厂），水为高纯水，95%乙醇（分析纯，江西同盟试剂化工厂），乌索酸和齐墩果酸对照品（

7、中国药品生物制品检定所提供，批号110742200314，110709200304，供含量测定用）。冬凌草(市售，购自樟树药材市场)，经本所生药室鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米亚Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的干燥叶和地上部分。2  方法与结果2.1  溶液的制备2.2   检测波长的确定取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液进样，在190500 nm波长范围进行光谱扫描，其在流动相中的最大吸收波长均为203.4 nm (图1)，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了减少干扰，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210 n

8、m为检测波长信噪比高，峰形好，基线平稳6。2.3  色谱条件色谱柱为NUCLEODUR C18 RP柱(4.6 mm×250 mm，5 m)；流动相为甲醇水（8713，V/V）；流速0.8 ml·min-1；检测波长210 nm；柱温25°C，进样量10 l。乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10 000，分离度大于1.5。乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液及冬凌草样品溶液的HPLC色谱见图1。图1  乌索酸和齐墩果酸对照品紫外光谱（略）2.4   线性关系实验分别精密吸取对照品混合溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0

9、 l，按选定的色谱条件进样并测定峰面积。以峰面积（V·s）对进样量（g）进行线性回归，乌索酸和齐墩果酸的回归方程分别为            YUA=1.12×105X +3.68×103，r=0.999 6，   YOLA =1.35×105 X +2.11×103，r=0.999 5   表明当乌索酸进样量在0.064 41.288 g，齐墩果酸进样量在0.025 60.512 g时，线性关系良好。2.

10、5   仪器精密度实验精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液10 l进样，重复5次，测得乌索酸峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.6 %（n=5），齐墩果酸的峰面积RSD为0.9 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.6  方法重现性实验精密称取冬凌草样品5份，按上述方法配制样品溶液，精密吸取10 l进样分析，测得乌索酸含量的RSD为1.6 %（n=5），齐墩果酸含量的RSD为2.2 %(n=5)，表明方法重现性好。2.7  加样回收率实验精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的冬凌草药材6份，每组两份，按高，中，低3种浓度分别加入适量乌索酸和齐墩果酸对照品，

11、制备样品溶液，进样分析，乌索酸和齐墩果酸平均加样回收率分别为96.2 %和98.7 %，RSD为1.9%和0.9%。a.对照品  b.样品  1-齐墩果酸  2-乌索酸图2  对照品和样品的HPLC谱图（210 nm）（略）2.8  样品中乌索酸和齐墩果酸含量测定精密称取不同批次的冬凌草样品约3 g，制备样品溶液。精密吸取样品溶液10 l，分别进样，平行实验3次，测定乌索酸和齐墩果酸峰面积，外标法计算平均含量。结果见表1。表1  样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果（略）3  讨论   测定结果表明，冬凌草中

12、乌索酸和齐墩果酸的含量较高，为三萜酸类主要成分，两组份均具有抗肿瘤及抗炎抑菌等生物学效应，这与冬凌草抗炎、抗肿瘤的药理活性相一致。   冬凌草叶中乌索酸和齐墩果酸的含量明显高于地上部分，可能是由于茎的纤维含量高，质地相对致密，两种三萜酸在茎中的含量相对较低所致。中草药的药效不仅取决于活性组份的种类和含量高低，其药用部位也是决定因素之一。   建立的定量分析方法准确、快速，数据准确，重现性好，可用于冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量测定。【参考文献】  1 屈红丽,可 钰,尹 鹏，等.冬凌草中总黄酮提取工艺研究与含量测定J.时珍国医国药,2006,17(10)：1929.2 刘 净,梁敬钰,谢 韬.冬凌草研究进展J.海峡药学,2004,16(2)：1.3 张俊峰，刘加军，陆敏强，等.冬凌草甲素抑制人肝癌BEL7402细胞生长及诱导细胞凋亡的机制研究J.中草药,2006,37(10)：