人骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

1、人骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化 11-04-01 14:42:00 作者：马兆文，吴炜，陈瑜编辑：studa20【摘要】 目的 ：研究人骨髓来源的间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells，hBM-MSCs)在肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)诱导下，体外向肝样细胞的诱导分化。方法：通过密度梯度离心和贴壁培养法获得hBM-MSCs，分离的hBM-MSCs扩增传至第6代，流式细胞仪检测hBM-MSCs表面CD34、CD45、CD105、CD166表达。第6代hBM-MS

2、Cs生长达100%融合时采用两步法对hBM-MSCs进行诱导分化。第1第14天采用IMDM诱导培养基(含2% FCS、20 ng/mL HGF、20 ng/mL FGF-4)，第15第21天在上述培养基中加OSM(10 ng/mL)，促进诱导细胞的成熟，同时收集第0、第7、第14、第21天培养上清液标本，ELISA法测ALB浓度。诱导培养21 d后采用RT-PCR、免疫荧光技术检测诱导后肝细胞特异标志CK18、ALB的表达，PAS染色检测诱导MSCs糖原储存。结果：传至第6代的hBM-MSCs CD34、CD45表达阴性，CD105、CD166表达阳性。在细胞因子的作用下，经过21 d的体外培

3、养，hBM-MSCs形态发生变化，由长梭形变为多边形、类圆形，并具有肝细胞特异的表型和功能。RT-PCR可检测到CK18、ALB表达，免疫荧光可检测到诱导后细胞内CK18、ALB，培养上清中有ALB的分泌，且诱导后的肝样细胞内有糖原储存。结论：hBM-MSCs体外能转化为具有肝功能的肝样细胞。 【关键词】 间充质干细胞;人骨髓间充质干细胞;肝样细胞;细胞因子Abstract: Objective: To investigate the differentiation and induction ability of human bone marrow derived mesenchymal s

4、tem cells into hepatocyte-like cells induced by hepatocyte growth factor，fibroblast growth factor-4 and oncostatin Min vitro. Methods: Mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow were selected with density gradient centrifugation and plastic adherence. Flow cytometry was performed using the

5、 following mouse anti-human antibodies: anti-CD34 FITC， anti-CD45 FITC， anti-CD105 PE， anti-CD166 APC. The sixth generation MSCs were incubated with the each antibody and analyzed with a FACS-Calibur with CellQuest software. For hepatogenic differentiation，the sixth generation cells reaching 100% co

6、nfluence were induced by 2-step methed. Differentiation was induced by treating sixth generation MSCs with Step-1 differentiation medium， consisting of IMDM supplemented with 2% FCS， 20 ng/mL HGF and 20 ng/mL FGF-4 for 14 days， followed by treatment with step-2 maturation medium， consisting of IMDM

7、supplemented with 2% FCS， 20 ng/mL HGF， 20 ng/mL FGF-4，10 ng/mL oncostatin M. Medium changes were performed twice weekly. After 21 days culture，mRNA of ALB and CK18 was assessed with reverse transcription polymerase chain reaction. Production of ALB and CK18 was assessed with immunofluorescence anal

8、ysis and Elisa. Glycogen deposits were visualised in cells fixed in paraffin with conventional periodic acid-Schiff (PAS) staining. Results: The sixth generation MSCs from human bone expressed CD105 and cd166，and were negative for CD34 and CD45. After 21 days culture，MSCs gained in vitro the charact

9、eristic morphology and function of hepatocytes. Cellolar morphology changed from a spindle to a rather polygonal shape typically. Differentiated hBM-MSCs were highly positive for glycogen，and expressed specific markers， such as CK-18 (cytokeratin 18) and ALB (albumin). Moreover， secretion of ALB by

10、differentiated hBM-MSCs increased as culture time went by. Conclusion: Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells in response to HGF， FGF-4 and OSM， which may be used as a kind of cell resources to treat severe hepatic disease.Key words: mesenchymal

11、 stem cells;human bone marrow-derived mesenchymal stem cells; hepatocyte-like;cytokine肝细胞移植、生物型人工肝是治疗肝衰竭的有效手段，却面临肝细胞来源缺乏的困境，因此寻找新的肝细胞源代替成体肝细胞尤为迫切1-2。骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells，hBM-MSCs)体外容易分离，免疫原性弱，可大量扩增3，把hBM-MSCs定向分化为肝细胞，将对肝病的治疗带来新的思路和新的前景。当前对骨髓体外向肝样细胞诱导分化没有统一的标准，细胞因

12、子之间组合、诱导分化时细胞生长融合状态也有争议。本实验探讨了生长100%融合时的hBM-MSCs，在肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)诱导培养下，向肝样细胞的转化，从而为骨髓间充质干细胞对肝衰竭的治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 实验材料 骨髓由浙江大学医学院附属第一医院骨髓室提供。L-DMEM培养基、胎牛血清(FCS)、PAS染色液、0.25%胰蛋白酶购于GIBCO公司，Ficoll分离液购于Stem Cell公司，鼠抗人FITC-CD34，FITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166抗体购于美国BD公司，HGF，FGF-4，

13、OSM购于Peprotec公司，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司，逆转录试剂盒购于Promega公司，PCR试剂盒购于大连宝诚公司，ALB测定试剂盒购于Bethyl公司。鼠抗人ALB，CK18抗体、兔抗鼠IgG-FITC购于美国BD公司。1.2 方法1.2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养：抽取肝素抗凝的健康成人骨髓5 mL，加等量体积的PBS稀释，加于5 mL Ficoll分离液中，1 500 r/min离心30 min。提取单个核细胞，PBS洗两遍，用L-DMEM培养基(含10%胎牛血清)配成浓度为2109/L细胞悬液接种于六孔培养板中，每3天换液1次。当细胞生长至80%融合时，

14、用0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2.2 第6代hBM-MSCs的鉴定：消化第6代hBM-MSCs，配成细胞浓度为1106/mL的细胞悬液。取100 L细胞悬液，加鼠抗人FITC-CD34，FITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166荧光抗体，同时加各荧光抗体的同型对照抗体，4 避光孵育30 min，流式细胞仪检测hBM-MSCs的纯度。1.2.3 MSCs诱导分化：当第6代MSCs生长100%融合时，按下述培养基诱导分化。第1第14天IMDM诱导培养基(含20 ng/mL HGF，20 ng/mL FGF-4，2% FCS)，第15第21天IMDM成熟培养基(含20 ng/mL

15、HGF，20 ng/mL FGF-4，2% FCS，10 ng/mL OSM)。1.2.4 RT-PCR检测诱导后ALB、CK-18的表达： 诱导后的细胞提取RNA，采用RT-PCR检测ALB、CK18 表达。ALB上游引物：5-GATGTCTTCCTGGGCA-3，ALB下游引物：5-CTTGGGCTTGTGTTTCAC-3，PCR产物长度645 bp，退火温度52 ;CK18上游引物：5-GAAGGAGACCATGCAAAGCCTG-3，下游引物：5-CATGAAGAGCAGCTCCTCCTTG-3，PCR产物长度400 bp，退火温度62 。内参采用GAPDH，GAPDH上游引物：5-C

16、CATGGAGAAGGCTGGGG-3，下游引物：5-CAAAGT TGTCATGGATGACC-3，PCR产物长度195 bp4。1.2.5 PAS染色测定诱导后的糖原表达：细胞爬片后，诱导培养21 d取玻片，4%的多聚甲醛固定后按说明书PAS染色。出现红色、紫红色颗粒说明糖原存在。1.2.6 免疫荧光测定诱导后MSCs细胞内ALB，CK18表达：第6代hBM-MSCs做细胞爬片，诱导培养21 d后，用PBS缓冲液洗细胞两遍，4%的多聚甲醛固定15 min，3%的甲醛H2O2液浸泡5 min，PBS缓冲液冲洗两遍，TritonX-100打孔，PBS洗两遍，加封闭血清20 min，滴加一抗(鼠

17、抗人ALB、CK18抗体)，4 过夜，滴加二抗(兔抗鼠IgG-FITC)，37 孵育90 min，PBS洗两遍，荧光显微镜观察。暗视野下绿色荧光为阳性。1.2.7 诱导培养上清液ALB测定：收集培养第0、第7、第14、第21天上清培养液，ELISA法测定上清中的ALB。2 结果2.1 hBM-MSCs体外培养 骨髓分离的PBMC细胞接种于六孔板中，3 d后可见到梭形、纺锤形、多角形细胞克隆生长，起初生长较慢，20 d左右可生长到80%90%融合，胰酶消化传代，传代后的细胞两个小时大部分贴壁，生长较快，一般来说35 d可增殖一倍，细胞形态变大，长梭形变成短梭形。图1和图2分别是原代和第6代细胞形

18、态。2.2 第6代hBM-MSCs的鉴定 流式细胞仪测定显示第6代hBM-MSCs CD105，CD166阳性，CD34，CD45阴性，MSCs纯度较高。结果见图3、图4。2.3 刺激21 d后hBM-MSCs形态变化 诱导组hBM-MSCs出现明显的细胞形态、体积变化，可见细胞由梭形变为三角形、多角形或类圆形。见图5、图6。2.4 RT-PCR检测ALB，CK-18表达 RT-PCR可以检测到明显的ALB，CK18条带，ALB的PCR产物为645 bp，CK18的PCR产物为400 bp，与目的条带相符。见图7、图8。2.5 PAS染色结果 21 d诱导后的MSCs细胞内可见红色、紫红色颗粒

19、，说明糖原有表达。见图9、图10。2.6 免疫荧光测定细胞内ALB，CK18 MSCs诱导培养21 d可以检测到细胞内ALB，CK18表达。显微镜下呈绿色荧光，图11、图12是诱导后MSCs细胞内ALB，CK18测定结果。2.7 上清液ALB测定 分别取诱导培养液第0、第7、第14、第21天上清培养液测定ALB的浓度。依据标准曲线和样品浓度计算公式，得出上清中ALB的浓度，结果如表1。3 讨论肝细胞的来源是肝细胞移植、生物型人工肝首先要解决的问题。hBM-MSCs作为组织工程和基因工程的种子细胞有比较明显的优势它贴壁生长，容易获得，体外增殖能力强;通过反复换液，可以除去悬浮生长的造血干细胞，因此容易纯化;更重要的是在体外