SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

1、 SDSSDSPAGEPAGE测定蛋白质测定蛋白质 相对分子质量相对分子质量学习学习SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。 运用运用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴测定蛋白质分子量及染色鉴定。定。带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。于分子的大小、构型和带电量的大小。 聚

2、丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）是由）是由丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)在在四甲基乙二胺四甲基乙二胺 TEMEDTEMED 和和过过硫酸铵硫酸铵(AP) (AP) 的作用下的作用下。以此以此凝胶作为支持介质的电泳称为凝胶作为支持介质的电泳称为。 具有电泳和分子筛的双具有电泳和分子筛的双重作用。重作用。 CH2=CHC=ONH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CHCH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH

3、2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )mPAGPAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，分为连续系统和不连续系统两大类。分为连续系统和不连续系统两大类。缓冲液缓冲液pHpH值与凝胶中的相同值与凝胶中的相同. .带电颗粒在电场带电颗粒在电场作用下，主要作用下，主要。带电带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。佳。 SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加

4、入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处理液，样品处理液，是一种很强的是一种很强的，它，它可以可以，破坏蛋白质分子的二，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。级和三级结构。可以可以破坏蛋白质的四级破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电荷的充分结合形成带负电荷的 蛋白质分子蛋白质分子阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净

5、电荷的差异。带净电荷的差异。而与其所带电荷的性质无关而与其所带电荷的性质无关。 将已知分子量的将已知分子量的在在 中的电泳迁中的电泳迁移率移率，即可得到一条标准曲线。，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,00017,000165,000165,000之间时，之间时， 的电泳迁移率与蛋白质分子量的对的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：数呈线性关系： 用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的

6、用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。 配制配制12%12%分离胶。在烧杯中依次加入分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水重蒸水3.35ml,3.35ml,分离胶缓冲液分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.81.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS 0.1ml,2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液凝胶储备液4.0ml4.0ml，10% 10% 过硫酸铵过硫酸铵50ul50ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEM

7、ED相遇后凝胶相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加1cm1cm的空间停止灌胶，小心的空间停止灌胶，小心覆盖一层蒸馏水，覆盖一层蒸馏水，3737烘箱下聚合（约烘箱下聚合（约30 min30 min）。待分离胶聚合完全）。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水。后，除去覆盖的蒸馏水。 配制配制5%5%浓缩胶。在烧杯中依次加入浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水重蒸水2.92ml,2.92ml,浓缩胶浓缩胶缓冲液缓冲液(0.5mol/L Tri

8、s-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝胶储备液凝胶储备液0.8ml0.8ml，10% 10% 过硫酸铵过硫酸铵25ul25ul和和TEMED 10ulTEMED 10ul。由于。由于APAP和和TEMEDTEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，插入梳齿，避免混入气泡，3737

9、烘箱下聚合（约烘箱下聚合（约30 min30 min）。）。 低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒: :兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 开封后，沸水浴中加热开封后，沸水浴中加热3-5min3-5min后上样。后上样。 用移液枪小心吸取处理好的血清用移液枪小心吸取处理好的血清50ul50ul至至1.

10、5ml1.5ml的离心管中，再加入的离心管中，再加入50ul50ul上样缓冲液，混匀后上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热沸水浴中加热3min3min，取出冷却后加样。，取出冷却后加样。 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为打开电泳仪开关，设置电压为200V200V，电泳电泳60mins,60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。泳，关闭电源。 用移液器分别取用移液器分别取5 l l样品液，小心将样品加样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。到凝胶凹形样品槽底部。 量出加样端距细

11、铜丝间的距离量出加样端距细铜丝间的距离(cm)(cm)以及各蛋白质样品以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离区带中心与加样端的距离(cm)(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对迁移率m mR R： 相对迁移率相对迁移率m mR R= =蛋白质样品迁移距离蛋白质样品迁移距离(cm)(cm)溴酚蓝区带距加样端距离溴酚蓝区带距加样端距离(cm)(cm)电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色染色液染色60 mins60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。带清晰，即可计算相对迁移率。1、在上样缓冲液中在上样缓冲液中SDS